一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。所述用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针包括用于检测所述UGT1A1*6基因多态性的UGT1A1*6多态性的引物和探针、以及用于检测所述UGT1A1*28基因多态性的UGT1A1*28多态性的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物。所述试剂盒包括：上述引物和探针。本发明专利技术提供的引物和探针能够高灵敏地检测UGT1A1基因多态性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及非诊断目的的检测方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及非诊断目的的检测方法。
技术介绍
伊立替康(irinotecan，CPT-11)是喜树碱半合成衍生物，伊立替康在体内经竣酸酯酶(carboxylesterases，CE)水解转化为7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin，SN-38)，伊立替康是治疗转移性结直肠癌(metastaticcolorectalcancer，mCRC)最有效的化疗药物之一。伊立替康经静脉注射后，在体内转化为细胞毒性更强的活性代谢产物SN-38后，经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶家族(uridinediphosphateglucuronosyltransferases，UGTs)灭活为葡萄糖醛酸产物(10-O-glucuronyl-SN-38，SN-38G)后，经胆汁排泄入肠，在肠道细菌β-葡萄糖醛酸酶作用下转换为SN-38后能够引发肠黏膜损伤及迟发性腹泻；而肠道内的UGTs酶又可再度催化SN-38为SN-38G解毒，人类的UGTs被分为UGT1和UGT2两个家族，UGT1基因至少包括13个亚型其中包括UGT1A1，其中UGT1A1基因多态性的表达及其活性与伊立替康的疗效及不良反应均密切相关。UGT1A1基因启动子区TATA盒区域的变化，在CPT-11治疗中，UGT1A1*28等位基因的存在导致活性代谢产物SN-38的显著增加，从而发生腹泻或中性粒细胞减少的几率显著增加。提示UGT1A1基因型的检测可用于临床预测与CPT-11相关的严重毒副作用的发生。同时，在亚洲人群应用伊立替康进行治疗的患者中UGT1A1*6(第1外显子211位)杂合突变型G/A和纯合突变型A/A显著增加患者发生3～4级中性粒细胞减少、血小板减少及腹泻的风险，针对以上突变的患者临床需减少伊利替康给药剂量，以控制毒副作用，通过对人UGT1A1基因启动子区TATA盒区域和第1外显子211位核苷酸基因多态性进行检测，从基因水平上预测伊利替康对肿瘤患者的毒副作用，为临床医生制定伊利替康的给药剂量提供参考。目前基因突变检测的“金标准”仍然是测序法，但传统的测序方法步骤繁琐，操作时间长，同时，测序法检测的灵敏度低，不能准确检测出UGT1A1基因的多态性，使用者迫切需要一种高灵敏度的检测方法替换Sanger测序法
技术实现思路
为了解决现有技术中检测UGT1A1基因多态性的方法的灵敏度低的问题，本专利技术实施例提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及非诊断目的的检测方法。所述技术方案如下：一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针，所述用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针包括用于检测所述UGT1A1*6基因多态性的UGT1A1*6多态性的引物和探针、以及用于检测所述UGT1A1*28基因多态性的UGT1A1*28多态性的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，UGT1A1*6多态性的正向引物如序列表中SEQIDNO.1所示；UGT1A1*6多态性的反向引物如序列表中SEQIDNO.2所示；UGT1A1*6多态性的探针如序列表中SEQIDNO.3所示；UGT1A1*28多态性的正向引物如序列表中SEQIDNO.4所示；UGT1A1*28多态性的反向引物如序列表中SEQIDNO.5所示；UGT1A1*28多态性的探针如序列表中SEQIDNO.6所示；所述探针的5’端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。另一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括：上述的引物和探针。具体地，所述试剂盒还包括：PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。具体地，所述PCR反应液包括：含Mg2+的5×PCR缓冲液5μl、2.5mmol/LdNTPs1.5μl、5U/μlTaq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA2μl。具体地，所述消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。具体地，所述测序反应液包括：0.3μl5×Bigdye、0.45μl2.5×Buffer、3μmol/L如序列表中SEQIDNO.5所示的UGT1A1*28多态性的反向引物1μl和3μmol/L如序列表中SEQIDNO.1所示的UGT1A1*6多态性的正向引物1μl。具体地，所述测序PCR产物纯化试剂包括0.75mol/LNaCl和纳米磁珠。具体地，所述阴性质控品为含有UGT1A1野生型基因片段的重组质粒。具体地，所述阳性质控品为含有UGT1A1基因多态性片段的重组质粒。又一方面，本专利技术实施例提供了一种非诊断目的的检测UGT1A1基因多态性的方法，采用上述的试剂盒，所述方法包括：提取样本的基因组DNA；以获得的所述基因组DNA作为所述模板DNA，采用所述试剂盒进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物；将所述纯化的PCR扩增产物作为模板，进行测序PCR扩增，得到测序PCR扩增产物；将所述测序PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的所述测序PCR扩增产物测序分析，并与所述UGT1A1基因多态性对应的野生型进行对比，判定所述样本中的所述UGT1A1基因多态性。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供的引物和探针具有高灵敏度，能够准确检测UGT1A1基因多态性。本专利技术提供的试剂盒包括本专利技术实施例提供的引物和探针，使得本专利技术实施例提供的试剂盒具有高灵敏度。本专利技术实施例提供的检测方法，能够准确检测UGT1A1基因多态性，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行扩增，扩增情况可以通过扩增曲线和Ct值判断，这能显著提高基因多态性的检测灵敏度。PCR扩增产物采用碱性磷酸酶和核酸外切酶进行消化，这能有效去除PCR扩增产物中残留的dNTP、引物和单链DNA等，省去了凝胶电泳的步骤，不但节省了时间还避免了污染，此外，本专利技术实施例采用磁珠法对测序PCR产物进行纯化，与传统的乙醇/醋酸钠法相比操作简单快捷、对设备要求简单(只需一个磁力架)、纯化结果稳定，得到的测序峰图干净清晰、无染料峰。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例三提供的UGT1A1*6多态性的测序峰图；图2是本专利技术实施例三提供的UGT1A1*28多态性的测序峰图；图3是本专利技术实施例三提供的扩增曲线图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。实施例一本专利技术提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针，用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针包括用于检测UGT1A1*6基因多态性的UGT1A1*6多态性的引物和探针、以及用于检测UGT1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针，其特征在于，所述用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针包括用于检测所述UGT1A1*6基因多态性的UGT1A1*6多态性的引物和探针、以及用于检测所述UGT1A1*28基因多态性的UGT1A1*28多态性的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，UGT1A1*6多态性的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；UGT1A1*6多态性的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；UGT1A1*6多态性的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；UGT1A1*28多态性的正向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；UGT1A1*28多态性的反向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；UGT1A1*28多态性的探针如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述探针的5’端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针，其特征在于，所述用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针包括用于检测所述UGT1A1*6基因多态性的UGT1A1*6多态性的引物和探针、以及用于检测所述UGT1A1*28基因多态性的UGT1A1*28多态性的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，UGT1A1*6多态性的正向引物如序列表中SEQIDNO.1所示；UGT1A1*6多态性的反向引物如序列表中SEQIDNO.2所示；UGT1A1*6多态性的探针如序列表中SEQIDNO.3所示；UGT1A1*28多态性的正向引物如序列表中SEQIDNO.4所示；UGT1A1*28多态性的反向引物如序列表中SEQIDNO.5所示；UGT1A1*28多态性的探针如序列表中SEQIDNO.6所示；所述探针的5’端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。2.一种用于检测UGT1A1基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的引物和探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：含Mg2+的5×PCR缓冲液5μl、2.5mmol/LdNTPs1.5μl、5U/μlTaq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA2μl。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：林佳，李品，霍然，唐景峰，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42