本发明专利技术属基因技术领域，本发明专利技术涉及一种用于检测X盒结合蛋白1s基因表达水平的引物组合。用于检测人源性X盒结合蛋白1s基因表达水平的引物组合。本发明专利技术设计的两套引物可特异性检测XBP1s和RPL19基因的mRNA表达水平，无非特异性扩增，所选择的管家基因表达水平不受内质网应激影响，可对XBP1s基因的表达水平进行准确定量。本发明专利技术的检测系统采用SYBR green荧光染料方法，无需使用探针，试剂使用方便，只需加入相关检测模板即可，不需要繁琐的操作步骤，检测只需 1.2h即可完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因
，本专利技术涉及一种用于检测X盒结合蛋白1s基因表达水平的引物组合。
技术介绍
X盒-结合蛋白1（X box-binding protein1,XBP1）mRNA为转录因子ATF6的诱导产物，XBP1 mRNA编码具有碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，Bzip）结构的转录因子。XBPl作为未折叠蛋白反应的一个重要转录因子，具有两种类型：剪接型的XBPls和非剪接型的XBPlt。磷酸化激活肌醇依赖酶1（inositol requiring enzyme1,IRE1）的核酸内切酶活性，可以与底物XBP1t前体mRNA分子结合，并剪切其26个碱基的内含子，产生新的mRNA转录本，翻译生成有活性的转录因子X盒-结合蛋白1s（X box binding protein 1 splicing，XBP1s）。XBP1s进入细胞核后与内质网应激反应元件的基因启动子结合，诱导CHOP、GRP78等分子伴侣和折叠酶基因的表达，上调内质网相关蛋白降解，加快蛋白折叠和错误蛋白降解。XBPls参与细胞分化、炎症反应等过程。研究发现XBPls在肝细胞癌中高度表达，其通过与Ⅱ型主要组织相容性复合物(HLA)基因启动子结合调控其表达。XBP1s是细胞分化的一个调控因子，可促进细胞分化，Reimold等发现XBPl是调控肝细胞生长的一个重要转录因子，同位素示踪技术证实XBPl基因敲除小鼠的肝组织中肝细胞生长率降低、凋亡细胞增多。另有研究发现XBP1s可能通过激活JNK信号通路介导了IL-1β诱导的腹膜间皮细胞的炎症反应。XBPls与各种细胞的存活与凋亡密切相关。Gomez等研究发现，XBPls的过度表达能降低乳腺癌细胞中雌激素受体的依赖性，改变了许多与细胞凋亡和细胞周期有关的基因表达，通过影响线粒体凋亡通路的活性促进MCF-7和T47D细胞的存活。在氧化应激介导的细胞损伤过程中，XBPls具有重要的保护作用，过度表达XBPls能够恢复XBPl缺失细胞中过氧化氢酶的表达，起到保护细胞不受损伤的作用。对糖尿病肾脏损害的研究发现，高糖刺激细胞XBP1s的表达降低，细胞外基质蛋白合成增加，导致细胞凋亡与坏死增加。可见XBP1s与多种疾病的发生、发展过程相关，通过对不同疾病模型中XBP1s表达水平的研究可为许多疾病的研究提供了新的思路，为进一步阐明疾病的发病机制提供了新的方法。对XBP1s表达水平的研究除采用免疫组化、ELISA和Western免疫印迹等方法从蛋白水平进行研究外，也可从mRNA水平研究XBP1s的表达水平,包括半定量反转录PCR和荧光定量PCR方法等。以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。荧光定量PCR方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单,可应用SYBR green染料法检测，无需使用荧光探针，设计简单，采用荧光定量PCR相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助XBP1s表达水平的研究，整个PCR反应过程只需1.2小时即可完成。细胞管家基因需选择维持细胞最低限度功能所不可少的、在所有细胞中均要表达的一类基因，且表达水平受环境因素影响较小。有研究表明比较常用的actin管家基因受内质网应激影响，表达量会减少，不适宜用于内质网应激的参考基因。核糖体蛋白基因产物是维持细胞生命活动所必须的，表达于所有细胞中，其表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节,可用作内质网应激的参考基因。
技术实现思路
本专利技术通过设计人源性XBP1s基因的特异性引物和核糖体蛋白RPL19基因的特异性引物，将其用于XBP1s基因表达水平的检测。本专利技术的工作原理是应用荧光定量PCR SYBR green荧光染料的方法根据相对定量原理，即2-△△CT法确定基因表达水平。本专利技术包含两套引物系统，一套引物是针对人源性XBP1s基因的特异性引物；另一套引物是针对人的核糖体蛋白RPL19基因设计的特异性引物。根据NCBI公布的human XBP1s mRNA序列（序列号：NM_001079539.1）设计XBP1s引物序列见表1：表1.XBP1s引物设计引物名称序列F-XBP1sCTGAGTCCGCAGCAGGTGR-XBP1sTGTCCAGAATGCCCAACAGG根据NCBI公布的human RPL19的mRNA序列（序列号：NM_000981.3）设计引物序列见表2：表2.RPL19引物设计引物名称序列F-rplCGAGCGAGCTCTTTCCTTTR-rplAGACCTTCTTCTTGCCACAGC技术效果 本专利技术设计的两套引物可特异性检测XBP1s和RPL19基因的mRNA表达水平，无非特异性扩增，所选择的管家基因表达水平不受内质网应激影响，可对XBP1s基因的表达水平进行准确定量。本专利技术的检测系统采用SYBR green荧光染料方法，无需使用探针，试剂使用方便，只需加入相关检测模板即可，不需要繁琐的操作步骤，检测只需 1.2h即可完成。附图与说明附图1为本专利技术实施例1中 XBP1s和RPL19基因扩增产物的融解曲线，其中A图为XBP1s基因扩增产物的融解曲线；B图为RPL19基因扩增产物的融解曲线。附图2. 为本专利技术实施例2中Manf蛋白对PD细胞模型XBP1s基因表达水平的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本专利技术实施例中采用诺唯赞的Acetaq SYBR supermix，采用25微升反应体系，荧光定量PCR仪采用ABI7500。利用本专利技术的特异性引物组合和方法检测人源性XBP1s基因表达水平时，基本操作为：步骤1.细胞RNA提取采用商品化试剂盒提取细胞RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，并控制提取质量OD260/280～2.0。本专利技术实施例采用天根总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，具体操作按说明书进行；步骤2.cDNA反转录取大约500ng RNA采用商品化试剂盒进行cDNA反转录。本实施例采用Takara的商品化试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）进行反转录，具体操作按说明书进行；步骤3.荧光定量PCR反应实验中每种模板分别加入两种荧光定量PCR反应体系中分别进行XBP1s和RPL19基因检测，一种反应体系包含组分如下：1×Acetaq SYBR supermix上游引物（F-XBP1s） 各0.1～0.5μM下游引物（R-XBP1s） 各0.1～0.5μM模板（1:5稀释的cDNA) 5μl总体积 25μl另一种为：1×Acetaq SYBR supermix上游引物（F-rpl） 各0.1～0.5μM下游引物（R-rpl） 各0.1～0.5μM模板（1:5稀释的cDNA) 5μl总体积 25μl荧光定量PCR反应条件：95℃ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测人源性XBP1s基因表达水平的特异性引物组合，该组合包含以下引物序列：XBP1s基因检测的引物组合：上游引物F‑XBP1s：CTGAGTCCGCAGCAGGTG下游引物R‑XBP1s：TGTCCAGAATGCCCAACAGGRPL19内参基因检测的引物组合：上游引物F‑rpl：CGAGCGAGCTCTTTCCTTT下游引物R‑rpl：AGACCTTCTTCTTGCCACAGC。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测人源性XBP1s基因表达水平的特异性引物组合，该组合包含以下引物序列：XBP1s基因检测的引物组合：上游引物F-XBP1s：CTGAGTCCGCAGCAGGTG下游引物R-XBP1s：TGTCCAGAATGCCCAACAGGRPL19内参基因检测的引物组合：上游引物F-rpl：CGAGCGAGCTCTTTCCTTT下游引物R-rpl：AGACCTTCTTCTTGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋明，于丽华，郭佳，章程，
申请(专利权)人：同济大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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