本发明专利技术公开了海藻糖合成酶突变体及其基因，该酶由耻垢分枝杆菌（mycobacterium smegmatis）海藻糖合成酶突变而来，具体涉及将该酶的第167位、第169位、第174位、第175位及第176位的氨基酸突变为丙氨酸；其中，任选将第169位氨基酸突变为丙氨酸与第167位、第174位、第175位及第176位的氨基酸突变为丙氨酸进行组合。经该突变后，相比于野生型酶，酶活最高提高2.56倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体的，涉及酶工程领域，一种海藻糖合成酶的突变体、基因、重组载体、转基因细胞以及、组合物在催化合成海藻糖中的应用。
技术介绍
海藻糖（Trehalose），分子式为C12H22O11•2H2O，是两个葡萄糖分子以α,α-1,1糖苷键结合形成的二糖；海藻糖无半缩醛羟基，是非还原性糖，化学性质稳定。由于海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，因此被誉为“生命之糖”。这一特性，使得海藻糖除了可以作为生物制品的活性保护剂和保持细胞活性以外，在化妆品和食品中也有着极大的用处，因此具有广阔的市场前景和应用价值。目前，在所有生产海藻糖的方法中，最简单的工艺是：海藻糖合成酶（Trehalosesynthase）以麦芽糖为底物，通过分子内转糖基一步催化反应直接生成海藻糖。反应无需中间步骤，原料成本低廉，工艺简单，具有很高的工业应用价值；但海藻糖合成酶也有部分缺点，主要有转化率低、副产物得率高、温度和pH耐受性差等。利用基因工程和酶工程手段，提高海藻糖合成酶的活性，及其耐受特性，提高催化合成反应中海藻糖效率是实现海藻糖高效生产的必由之路。在目前对海藻糖合成酶的深入研究中，证明海藻糖合成酶是糖基水解酶13家族（Glycosidehydrolasefamily13，简称FamilyGHl3，也称α-淀粉酶家族）成员之一。该家族的酶类都具有一个典型的(β/α)8桶装催化结构域。已发现有三种不同来源的海藻糖合成酶结构已经被解析出来，分别来自Mycobacteriumtuberculosis、Deinococcusradiodurans、Mycobacteriumsmegmatis三种不同的菌，其PDB编号分别为：4LXF、4TVU、3ZO。专利技术人根据不同结构的比对和氨基酸的亲疏水性，在尝试不同区域的位点突变以后，发现突变后酶相比于原野生型有明显提高，基于此完成本专利技术方案。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，现有源于耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis的海藻糖合成酶活性过低，为了提高该酶的活性，本专利技术提供了来源于耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis的海藻糖合成酶突变体，该酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2、4、6、8或10所示。在本专利技术中，专利技术人尝试在不同区域进行该酶的位点突变，发现，在第167位、第169位、第174位、第175位及第176位的氨基酸突变为丙氨酸；突变后酶相比于原野生型有明显提高，基于此完成本专利技术方案。具体的，本专利技术的方案为：将来源于耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis野生型海藻糖合成酶的第167位、第169位、第174位、第175位及第176位的氨基酸突变为丙氨酸；其中，任选将第169位氨基酸突变为丙氨酸与第167位、第174位、第175位及第176位的氨基酸突变为丙氨酸进行突变组合；即得到R169A、R169A-D174A、R169A-D174A-D167A、R169A-D174A-D167A-T175A、R169A-D174A-D167A-T175A-E176A五个突变体。优选将第169位氨基酸突变为丙氨酸。相应的，该酶突变体基因的核苷酸序列如SEQIDNO：:1、3、5、7或9所示。本专利技术所述的重组载体，包含有上述的基因序列，即在现有的载体、质粒中导入本专利技术中的基因序列，即可以实现。含有上述基因的转基因细胞，例如，大肠杆菌、酵母细胞、枯草芽孢杆菌细胞等。优选在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中表达上述基因。组合物，其中，该组合物中将上述任一酶突变体作为活性成分，优选用于催化合成海藻糖。上述酶突变体、基因、重组载体、转基因细胞以及组合物在催化合成海藻糖中的应用。本专利技术的有益效果在于，R169A、R169A-D174A、R169A-D174A-D167A、R169A-D174A-D167A-T175A、R169A-D174A-D167A-T175A-E176A五个突变体，突变后的酶活力分别比野生型的酶活力提高1.07倍、1.05倍、2.56倍、2.41倍、1.94倍。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本专利技术的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。实施例1海藻糖合成酶突变体的制备根据mycobacteriumsmegmatis来源的海藻糖合成酶的基因序列，分别依次设计并依次合成引入R169A、R169A-D174A、R169A-D174A-D167A、R169A-D174A-D167A-T175A、R169A-D174A-D167A-T175A-E176A五种突变体的引物，依次分五步对海藻糖合成酶进行定点突变，测定DNA编码序列。鉴别出第169位的Arg密码子变为Ala密码子。在上一步的基础上，将第174位Asp密码子变为Ala密码子。在上一步的基础上，将第167位Asp密码子变为Ala密码子。在上一步的基础上，将第175位Thr密码子变为Ala密码子。在上一步的基础上，将第176位Glu密码子变为Ala密码子。将突变体基因连接适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到五种不同突变的海藻糖合成酶。具体的，第一步：以原始质粒TreS-pET22b为模板，引入R169A突变的定点突变引物为：正向引物：5-aggtatcccgacgcggccatcatcttcgtcgac-3反向引物：5-gtcgacgaagatgatggccgcgtcgggatacct-3第二步：以突变体R169A为模板，引入D174A突变的定点突变引物为：正向引物：5-gccatcatcttcgtcgccaccgaggagtcgaac-3反向引物：5-gttcgactcctcggtggcgacgaagatgatggc-3第三步：以突变体R169A-D174A为模板，引入D167A突变的定点突变引物为：正向引物：5-agcgacaggtatcccgccgcggccatcatcttc-3反向引物：5-gaagatgatggccgcggcgggatacctgtcgct-3第四步：以突变体R169A-D174A-D167A为模板，引入T175A突变的定点突变引物为：正向引物：5-atcatcttcgtcgccgccgaggagtcgaactgg-3反向引物：5-ccagttcgactcctcggcggcgacgaagatgat-3第五步：以突变体R169A-D174A-D167A-T175A为模板，引入E176A突变的定点突变引物为：正向引物：5-atcttcgtcgccgccgcggagtcgaactggacg-3反向引物：5-cgtccagttcgactccgcggcggcgacgaagat-3。PCR反应体系均为：5XPSbuffer10μL，dNTPsMix4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimerStarHS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件均为：98℃预变性5min，随后28个循环（98℃15s，58℃30s，68℃6min），68℃延伸10本文档来自技高网...
【技术保护点】
来源于耻垢分枝杆菌mycobacterium smegmatis的海藻糖合成酶突变体，其特征在于，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示。
【技术特征摘要】
1.来源于耻垢分枝杆菌mycobacteriumsmegmatis的海藻糖合成酶突变体，其特征在于，该酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2、4、6、8或10所示。2.海藻糖合成酶突变体基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1、3、5、7或9所示。3.重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，王东生，江凌，周家海，徐晴，
申请(专利权)人：南京工业大学，中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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