β‑扩张蛋白基因GmEXPB2的应用制造技术

本发明专利技术公开了β‑扩张蛋白基因GmEXPB2的新应用，具体公开的是β‑扩张蛋白基因GmEXPB2在提高豆科植物氮效率方面的新应用。发明专利技术人通过定量PCR及化学组织定位方法，鉴定了一个在大豆根瘤形成早期高度表达的β‑扩张蛋白基因GmEXPB2，该基因参与调控了根瘤原基、皮层细胞、薄壁细胞及早期根瘤微管组织的发育；利用大豆转基因复合植株及整株转化植株研究表明，过量表达GmEXPB2显著增加了大豆根瘤数量和重量、提高了植株氮含量，最终增加了转基因植株的生物量；发明专利技术人的研究将为包括大豆在内的豆科作物氮高效和高产分子育种提供基因资源，以及对发展环境友好型可持续农业具有重要的理论和实践意义。

【技术实现步骤摘要】
β-扩张蛋白基因GmEXPB2的应用
本专利技术涉及基因的新应用，具体涉及β-扩张蛋白基因GmEXPB2在提高豆科植物氮效率方面的新应用，属于生物

技术介绍
大豆[Glycinemax(L.)Merr]起源于中国，是世界范围内重要的粮食、油料、饲料和能源作物，在人们生活食品结构中占有重要地位(Palanderetal.,2005)。近年来，随着大豆消费的增长以及养殖业的飞速发展，国内大豆供求出现严重失衡，我国大豆生产和需求间的矛盾日益突出。2000年起，我国就已从传统的大豆出口国变成现今世界上最大的进口国(杨文钰等2008)。最新数据显示，2013年我国大豆进口量达6338万吨，同比增加8.6％，创记录高位(中国粮油信息网，http://www.chinagrain.cn/dadou/2014/1/13/201411313313124408.shtml)。因此，为满足国内对大豆消费的需要，我国有必要大力发展大豆产业，解决大豆供需矛盾，以减少对大豆进口的依赖。我国大豆生产水平较低，究其原因主要是土壤养分有效性较低，例如土壤缺氮，是限制大豆生产的主要因素之一。在长期的进化过程中，植物形成了一系列适应低氮胁迫的作用机制。其中，结瘤固氮是提高豆科作物氮效率的重要途径。根瘤菌侵染豆科植物根系所建立的共生体系，对农业生产及生态环境的可持续发展具有重要意义。研究表明，接种根瘤菌可提高豆科作物的固氮能力，改善氮营养，促进根系生长和提高作物产量(Ferreiraetal.,2009)。在美国、巴西等大豆主产国，接种根瘤菌已成为大豆增产的主要措施之一，已大面积推广和应用。而我国将根瘤菌接种技术应用于农业生产，也取得了良好的效益(汤复跃等2011；Mendesetal.,2003；Sogut2006；deFreitasetal.,2012)。根瘤的形成及器官膨大与细胞壁的形态建成密切相关，扩张蛋白(Expansin)是一类细胞壁松弛蛋白，在诱导细胞壁增大和软化、根瘤生长发育等方面扮演重要角色。然而，关于扩张蛋白在调控豆科作物结瘤固氮方面的研究非常有限，并且在大豆中，调控根瘤形成和发育的扩张蛋白基因尚未见报道。
技术实现思路
基于上述研究背景，专利技术人通过定量PCR及化学组织定位方法，鉴定了一个在大豆根瘤形成早期高度表达的β-扩张蛋白基因GmEXPB2。该基因参与调控了根瘤原基、皮层细胞、薄壁细胞及早期根瘤微管组织的发育。利用大豆转基因复合植株及整株转化植株研究表明，过量表达GmEXPB2显著增加了大豆根瘤数量和重量、提高了植株氮含量，最终增加了转基因植株的生物量。专利技术人的研究将为包括大豆在内的豆科作物氮高效和高产分子育种提供基因资源。本专利技术的有益之处在于：此项研究对增加包括大豆在内的豆科作物根瘤数量和重量、提高植株氮含量、增加转基因植株的生物量具有重要意义，对发展环境友好型可持续农业也具有重要的实践意义，同时也为高产分子育种提供了基因资源。附图说明图1为GmEXPB2基因表达模式分析；图2为大豆转基因复合植株中GmEXPB2启动子驱动GUS表达部位的解剖分析；图3为过量、干涉GmEXPB2对大豆转基因复合植株结瘤的影响；图4为过量、干涉GmEXPB2在高低磷处理下对大豆转基因复合植株生长和氮/磷含量的影响；图5为过量表达GmEXPB2对大豆转基因植株根系形态的影响；图6为过量表达GmEXPB2的转基因大豆接种根瘤菌USDA110-GFP的侵染过程；图7为高、低磷处理下过量表达GmEXPB2对大豆结瘤的影响；图8为过量表达GmEXPB2对大豆生长及氮/磷含量的影响。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。一、β-扩张蛋白基因GmEXPB2表达模式分析在已公布的大豆基因组数据库中，通过同源比对，预测出大豆β-扩张蛋白家族共有9个成员，通过定量PCR技术，确定GmEXPB2基因为根瘤增强表达的基因。GmEXPB2基因的开放阅读框长度为834bp，编码278个氨基酸的蛋白，属于β类细胞壁扩张蛋白。现有的研究表明，该基因与结瘤固氮密切相关，首先分析了其表达模式。大豆种子HN66用3％(v/v)H2O2表面消毒一分钟，在1/2全营养液润湿的石英砂中催芽萌发5天，接种根瘤菌1小时后转移到低氮(氮素：530μMNH4NO3+KNO3+Ca(NO3)2·4H2O)营养液中处理。分别收获处理第7天的根瘤，第18天的根、茎、叶、花及处理第29天的豆荚和种子并抽提RNA。对于比较分析GmEXPB2在不同生长时期根瘤中的表达量，收获接种根瘤菌后第4天的根系、第7、14、21、30、40天的根瘤及非接种根瘤菌的第7天根系，并抽取相应部位的RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmEXPB2的表达模式。大豆的看家基因EF-1a作为内参。用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为：大豆EF-1a基因的引物为：EF-1aF:5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’(SEQIDNO:1)EF-1aR:5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’(SEQIDNO:2)GmEXPB2基因的引物为：GmEXPB2F:5’-TGGTGCTTGTGGTTATGGAAGT-3’(SEQIDNO:3)GmEXPB2R:5’-TGAACCACACCCAGGACAGCT-3’(SEQIDNO:4)定量PCR反应程序为：将RNA样品反转录所得cDNA稀释50倍作为定量PCR反应模板。选取适量cDNA原液做梯度稀释为标准曲线的模板。试验中采用20μL反应体系，包括：10μL的2×SYBRGreenPCRmastermix，各0.6μL的10μM正反向引物，2μL稀释的cDNA，最后用Mili-Q水补至20μL。定量PCR反应条件为：95℃变性1分钟，然后94℃裂解15秒，60℃结合15秒，72℃延伸30秒并进行40次循环。用Rotor-Gene的Real-TimeAnalysisSoftware6.0计算每个样品的表达量。图1为GmEXPB2基因表达模式分析。其中：图1(A)为GmEXPB2在不同组织中的表达；图1(B)为GmEXPB2在不同发育时期根瘤中的表达。图中数据是3个生物学重复的平均值和标准误差。结果表明：(1)GmEXPB2在根瘤中的表达量最高，根部次之，在豆荚中亦存在微量表达，但在茎、叶、花和种子中检测不到该基因mRNA的积累，参见图1(A)。(2)对不同发育时期的根瘤进行qRT-PCR检测分析，发现GmEXPB2在接种4天后的根系中增强表达，当根瘤生长到第7天时表达量达到最大值，但随着根瘤的生长时间的延长，其表达量逐渐降低，当根瘤生长到30和40天时，几乎检测不到该基因的表达，参见图1(B)，暗示GmEXPB2参与调控早期根瘤的发育过程。二、GmEXPB2基因启动子克隆、载体构建及组织表达定位分析按照常规方法，提取大豆叶片或根部基因组DNA，以大豆基因组DNA为模板，用上游特异引物和下游特异引物扩增GmEXPB2启动子2742bp片段，PCR片段回收测序无误后，通过PstI和NcoI对回收片段及目的载体进行双酶切后，将GmEXPB2基因连接到目的载体pCAMBIA3301。其中，上游特异引物为：5’-CT本文档来自技高网...

【技术保护点】
β‑扩张蛋白基因GmEXPB2在提高豆科植物氮效率方面的新应用。

【技术特征摘要】
1.β-扩张蛋白基因GmEXPB2在提高大豆氮效率方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β-扩张蛋白基因GmEXPB2在大豆根瘤发育早期表达，并定位于根瘤原基、根瘤皮层和薄壁细胞。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与野生型大豆相比，过量表达GmEXPB2的转基因大豆显著增加了根系根毛区长度和根毛密度，进而间接扩大了根瘤菌与宿主根系的接触面积。4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖红，李欣欣，赵静，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44