一种根癌农杆菌介导的亚麻芥遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及一种根癌农杆菌介导的亚麻芥遗传转化方法，该方法将开花初期的亚麻芥花序浸入携带目的基因的载体质粒的根癌农杆菌菌液中，经真空渗透浸染、黑暗条件下共培养后，将亚麻芥植株恢复正常光照培养，直至收获T0代种子，播种T0代种子，获得T1代植株，利用质粒中含有的标记基因对种子或植株进行初步筛选，最终利用PCR扩增技术等鉴定携带目的基因的亚麻芥转基因植株。本发明专利技术方法相比于传统的浸染方法，转化率较高，成功实现了亚麻芥的遗传转化，不仅为改造亚麻芥转基因新品种用于功能性食品、生物燃料等领域奠定了基础，也为其它种类植物的基因改造提供了方法与技术上的借鉴。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种根癌农杆菌介导的亚麻芥遗传转化方法，其特征在于：所述方法是将预培育的开花初期的亚麻芥花序浸入含有目的基因和筛选基因质粒的根癌农杆菌菌液中，具体步骤如下：⑴工程菌株的构建与鉴定：采用CaCl2法制备根癌农杆菌感受态细胞，平均分装数管，24h内直接用于转化或液氮速冻后‑80℃保存待用；将含有标记基因的载体质粒导入根癌农杆菌感受态细胞中，每管中按根癌农杆菌感受态细胞：YEB液体培养基的体积比为1：8的比例加入YEB液体培养基，混匀后置于28℃环境中复苏2h；4000～5000r/min室温下离心45s，除去大部分上清液，取少部分上清液重悬菌体，少部分上清与每管根癌农杆菌感受态细胞的体积比为1：1，将重悬菌体涂布到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固体抗性平板培养基上；28℃倒置培养24‑48h，在YEB固体抗性平板培养基上得到抗性菌落；从YEB固体抗性平板培养基上随机挑取新鲜培养的根癌农杆菌菌株的阳性单菌落，接种到含50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养过夜；碱裂法提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测后，酶切鉴定重组质粒，取鉴定转化成功的根癌农杆菌单菌落待用；⑵待转化亚麻芥苗的准备：将蛭石、营养土、珍珠岩混合，该混合物要保证透气性和土壤的营养，均匀播撒亚麻芥种子，覆膜2‑3d以缓苗，保持在20/16℃(白天/夜晚)自然光照种植培育，当亚麻芥植株20％以下的花序处于完全开放、60％以上处于含苞时期时用于转化；⑶真空渗透介质的制备：挑取鉴定转化成功的根癌农杆菌单菌落接种于含50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃培养过夜得菌液；将菌液转接到体积为菌液本身100倍的上述YEB液体培养基中，28℃、180r/min持续振荡培养24‑48h，4000‑6000r/min离心10min，弃上清，用上述YEB液体培养基：无菌渗透培养基的体积比为1：40‑60的比例的无菌渗透培养基悬浮菌体，混合均匀，即制备得到转化植株的渗透介质，待用；⑷浸染与共培养：亚麻芥开花初期，把植株放入一个高于300mm的干燥器中，连接一真空泵，使亚麻芥花序倒置浸没于盛有上述渗透介质的干燥器中，真空泵抽真空保持85kPa转化5min；然后，用保鲜袋套住亚麻芥花序，置黑暗条件下共培养24‑48h，去袋，恢复在20/16℃(白天/夜晚)自然光照培育，直到种荚成熟，收获T0代种子；⑸转基因种子或植株的初筛：利用载体质粒所含有的标记基因对亚麻芥T0代种子或播种T0代种子而培育的T1代植株进行初筛；⑹转基因植株的鉴定：培育T1代植株，以初筛阳性的植株叶片为材料，提取植株DNA，针对标记基因或目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否可扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到亚麻芥转基因植株。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王昌禄，高瑞飞，李贞景，陈勉华，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12