本发明专利技术涉及一种抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的构建方法。本发明专利技术构建了包含草甘膦抗性基因cp4epsps和抗螟虫基因cry1C的遗传转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法、以草甘膦作为筛选剂，成功地将载体的T-DNA区单拷贝整合到水稻基因组中，并培育出抗螟虫、抗草甘膦、农艺性状优良的转基因水稻植株KCRC03，明确了外源T-DNA的插入位置并设计了特异性检测方法。本方法适用于转基因水稻的安全评估和检测，以及由该转化事件获得的转基因水稻为供体而得到的各种转基因水稻新品种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程及作物育种
具体地说，涉及一种抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的构建方法。
技术介绍
我国是世界上主要的水稻种植国和消费国，目前，中国水稻的种植面积位居全球第二，产量位居世界第一(苏少泉，滕春红。稻田除草剂的新发展。世界农药，2010，32:1-6.)。2011年，我国水稻的种植面积达到了3005.7万公顷，稻谷的年产量达到了20100.1万吨，占所有粮食产量的35.2％(中国统计年鉴，2012)。截至2008年底，我国的耕地面积已缩减至12171.6万公顷，近几年来耕地保有量也仅仅是维持在这一数量之上，而人口却以每年5‰的速度增长(中国统计年鉴，2012)。从以上的统计数据可以看出，水稻的安全、稳定的生产是保障国家粮食安全的关键。但是虫害和杂草等不良环境因素限制了水稻产量潜力的发挥。(1)昆虫危害问题：虫害是影响水稻生产的重要因素，每年造成的产量损失高达15％左右(张启发。绿色超级稻的构想与实践，2009，科学出版社)。当前对农作物害虫的防治措施还主要依赖化学农药。我国农药使用量全球第一，1990年用量不到30万吨，而2005年用量就已达到140万吨。农药的大量使用，既增加了农民的种植成本，减少了种粮收益，又造成了环境污染、农药残留、害虫抗药性增强以及杀伤天敌等一系列生态环境问题。Bt抗虫蛋白，主要对鳞翅目昆虫如水稻螟虫的幼虫有毒，有很强的专一性，通过培育转基因Bt抗虫水稻，能够有效的防治水稻螟虫的危害，减少农药使用量，增加农民的收入，降低农药使用对环境造成的危害。(2)杂草危害问题：稻田杂草与水稻在水、肥、生长空间上进行竞争，直接影响水稻的产量。近年来直播和抛秧等栽培方法的使用，使得稻田的杂草危害变得日益严重。另外，随着农村人口往城市迁移速度的加快，水稻种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草的方法变得不现实。施用除草剂是解决这些新出现问题的最佳方案之一。因此，抗除草剂杂交稻将具有很大的实际需求和市场潜力。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的构建方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术涉及转基因水稻事件，通过将抗虫抗除草剂基因构建到一个表达载体上使得受体植物同时具有抗虫抗除草剂的特性。通过多代的性状定向筛选和鉴定，得到了抗虫抗除草剂优异株系并分离了外源载体的侧翼序列，确定了其整合位点。该转化事件获得的转基因水稻植株不仅可以用来作为品种改良的供体，而且特异性检测方法的设计为鉴定与KCRC03转化事件含有同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的转基因植株提供了途径。本专利技术构建了包含草甘膦抗性基因cp4epsps(SEQIDNO:15)和抗螟虫基因cry1C(SEQIDNO:16)的遗传转化载体pZHZH15003，通过农杆菌介导的遗传转化方法、以草甘膦作为筛选剂，成功地将pZHZH15003的T-DNA区单拷贝整合到水稻基因组中，并培育出抗螟虫、抗草甘膦、农艺性状优良的转基因水稻植株KCRC03，明确了外源T-DNA的插入位置并设计了特异性检测方法。本专利技术提供抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的T-DNA区核苷酸序列，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的左边界侧翼序列为如SEQIDNO:2所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。本专利技术还提供抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的T-DNA区核苷酸序列，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的右边界侧翼序列为如SEQIDNO:3所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。本专利技术还提供了用于普通PCR定性检测KCRC03转化事件及基因型的特异性引物对，包括：LBF1:TAACCTTTTGACATCCACAATATACCA；LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT；RBR:ATTGTAGTTTAATTTGTTCATTTTGTTGC。本专利技术还提供了用于Realtime-PCR定量检测KCRC03转化事件的特异性引物对，包括：LBF2:ACACATCTTAACATCTATTCTTGTCTTCAAT；LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT。本专利技术还提供了抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的检测方法，包括以下步骤：1)提取待测转基因水稻的总DNA；2)以步骤1)的DNA为模板，利用引物SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7或SEQIDNO:5和SEQIDNO:6进行普通PCR或Realtime-PCR扩增；3)凝胶电泳分析PCR扩增产物或分析Realtime-PCR扩增曲线。本专利技术还提供所述检测方法在水稻育种中的应用。涉及对上述转化事件的水稻植株的检测，以进行转基因标识、含量分析、基因漂移研究及杂交育种跟踪等应用。所述植株包含但不限于亲本、自交后代、杂交后代的种子、花粉、雌蕊、叶片、根等各器官及植物细胞、植物组织等。本专利技术还提供所述检测方法在判断KCRC03转化事件的基因型中的应用，具体为：只有一条343bp大小带型的材料为KCRC03纯合基因型的材料；只有一条470bp大小带型的材料为不含KCRC03事件的材料；有两条带型且大小分别为343bp和470bp的材料为KCRC03杂合基因型的材料。本专利技术进一步提供抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的构建方法，包括以下步骤：(1)人工合成草甘膦和螟虫抗性基因cp4epsps和cry1C；(2)将步骤(1)中合成的基因构建到同一遗传转化载体pZHZH15003中；所述转化载体pZHZH15003的具体构建过程为：将CP4片段与PU130载体(该载体为pCambia3300的衍生载体，其构建过程是：pCambia3300经XhoI和HindIII酶切处理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)分别用BamHI和SacI酶切，连接后得到骨架载体Pubi-CP4-T35spolyA；PCR扩增rbcs启动子并在其两端分别添加HindIII和XmaI酶切位点，连接到来自Promega公司的克隆载体pGEM7Z上，获得中间载体7Z-rbcs；合成cry1C-Tnos片段并添加酶切位点XmaI和SphI；分别用XmaI和SphI切割该片段和中间载体7Z-rbcs，连接后得到中间载体Prbcs-cry1C-Tnos；使用PmeI单酶切骨架载体Pubi-CP4-T35spolyA，并用CIP处理去磷酸化；使用SacI酶切中间载体Prbcs-cry1C-Tnos，并补平粘性末端。连接上述处理后的骨架片段和插入片段Prbcs-cry1C-Tnos，构建得到pZHZH15003载体。(3)将步骤(2)中获得的重组载体通过农杆菌介导法导入到水稻品种‘空育131’中；具体步骤为：将构建得到的表达载体转化入农杆菌中；将农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织；将愈伤组织转移到添加了草甘膦的选择培养基上进行筛选培养，挑选抗性愈伤组织；将<本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的T‑DNA区核苷酸序列，其特征在于，所述T‑DNA区核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T‑DNA区核苷酸序列的左边界侧翼序列为如SEQ ID NO:2所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的T-DNA区核苷酸序列，其特征在于，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的左边界侧翼序列为如SEQIDNO:2所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。2.抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的T-DNA区核苷酸序列，其特征在于，所述T-DNA区核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的右边界侧翼序列为如SEQIDNO:3所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。3.用于普通PCR定性检测KCRC03转化事件及基因型的特异性引物对，包括：LBF1:TAACCTTTTGACATCCACAATATACCA；LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT；RBR:ATTGTAGTTTAATTTGTTCATTTTGTTGC。4.用于Realtime-PCR定量检测KCRC03转化事件的特异性引物对，包括：LBF2:ACACATCTTAACATCTATTCTTGTCTTCAAT；LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT。5.抗螟虫抗草甘膦转基因水稻KCRC03的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测转基因水稻的总DNA；2)以步骤1)的DNA为模板，利用权利要求3和权利要求4所述的特异性引物对进行普通PCR或Realtime-PCR扩增；3)分析PCR扩增产物或Realtime-PCR扩增曲线。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，DNA模板用量在15pg
\t以上。7.权利要求5所述检测方法在判断KCRC03转化事件的基因型中的应用，其特征在于，只有一条343bp大小带型的材料为KCRC0...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晨，杨倩倩，王晖，何实，李赢世，魏晶，刘莹，滕晓露，刘博林，马崇烈，章旺根，
申请(专利权)人：中国种子集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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