一种DNA‑Marker及其制备工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种用于指示DNA分子量大小的电泳条带清晰的DNA Marker及其制备工艺，属于生物技术领域。本发明专利技术据载体SEQ No.1设计一条上游引物，扩增长度分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp的7条下游引物，以载体SEQ No.1为模板对目的DNA片段进行PCR扩增，测定扩增产物含量并进行DNA片段配方优化，得到含有7个DNA片段100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp的DL2000 DNA Marker。本发明专利技术公开的DL2000 DNA Marker与市售DL2000 DNA Marker相比，多设计了一条1500bp的条带，且该方法适宜于根据自身需要制备含有能扩增到的不同大小片段的DNA Marker。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于指示核酸分子量大小的DNAMarker及其制备工艺。
技术介绍
20世纪70年代末至80年代初，由于近代生物学的不断发展，分子生物学、基因工程、DNA重组技术等的问世，基于生物遗传物质DNA为基础，从微观角度阐释生命活动规律的研发开展得如火如荼。在这些涉及核酸物质DNA的研发工作中，DNAMarker是最为广泛使用的试剂之一，它能判断和指示核酸分子量大小，用作核酸分子量标准和对核酸片段进行定量分析。DNAMarker含有不同分子量的DNA片段，其主要用途是在核酸的琼脂糖凝胶电泳时，用来指示核酸电泳中未知片段的分子量大小。据DNA分子量标准即DNAMarker制备所涉及的技术可分为用限制性内切酶酶切质粒及噬菌体DNA和PCR技术扩增，前者的主要不足是酶切位点过多或过少，使得酶切产物DNA大小过于接近或相差太远，不能按照目的DNA片段大小设计相符的DNA片段，在特定的实验中并不能很好的指定DNA的分子质量；由于PCR扩增具有强大的扩增DNA片段的能力，利用该技术制作DNAMarker不存在技术问题。已有学者基于PCR技术扩增出100-1000bp的DNA片段，制成DL1000Marker、利用多重PCR制备出DL1000DNAMarker。利用PCR技术制备DNA分子量标准的关键是目的DNA片段大小的设计、模板的选择、引物设计、PCR反应条件摸索，本专利技术所制备的DL2000DNAMarker制品比常规常品多设计了一条大小为1500bp的DNA片段，适宜用于分子量不高于2000bp目的DNA片段的指示，特别是利用原核微生物16SrDNA（约为1500bp）基因对其进行种属鉴定的试验中。本专利技术所用扩增模板序列为SEQNO1，大小约为5900bp，可用于5kb以下，能扩增到的目标大小DNA片段的扩增。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于指示核酸分子量大小的DNAMarker及其制备工艺本专利技术所提供的DL2000DNAMarker是由2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp共7条双链DNA片段组成，已混有上样缓冲液，可直接用于凝胶电泳，每次上样5μl；为便于电泳后观察，1000bp条带最亮，约为100ng，其它约为50ng；用作指示核酸电泳中未知大小DNA片段的分子量大小。本专利技术所提供的DL2000DNAMarker的制备工艺是以质粒SEQNo.1为模板，设计一条上游引物和7条下游引物，利用PCR扩增大小分别为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp的DNA片段，测定扩增产物含量并进行DNA片段配方优化，最后得到按照目的DNA条带大小设计的、经电泳及染色后条带清晰，密度适宜的DL2000DNAMarker。引物的设计与合成通过参照质粒SEQNo.1的序列DNA序列，结合Ediseq和PrimerSelect软件设计1个上游引物和7个下游引物，并送生物公司进行合成。其序列见表1：表1制备DNAMarker所用引物序列。菌种的活化及质粒提取菌种的活化：将JM109(SEQNo.1)甘油菌接至LB液体培养基中，于37℃140rpm过夜振荡培养8-10小时。用已活化的菌种均匀涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h后，挑取单菌落于液体培养基上，过夜摇床后提取质粒。质粒的提取：利用碱裂解法提取质粒DNA。目的DNA片段的PCR扩增及反应条件优化采用50μl的PCR反应体系，包括：ddH2O39μl、10×PCRBuffer5μl、10mM的dNTPs1μl、10μM的引物all-F1μl、10μM的下游引物-R1μl、DNA模板1μl、2U/μl的TaqDNA聚合酶1μl。扩增条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、退火温度49-54℃30s、72℃延伸1-3min、共30-35个循环、72℃再延伸10min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA目的条带。根据测定结果，进行PCR条件的优化，如改变PCR反应体系中的dNTPs的量，反应条件中的退火温度、循环转数以及延伸时间，使扩增的目的条带清晰且单一。表2各DNA片段的最佳PCR反应条件。DNAMarker设计该Marker中1000bp的DNA片段终浓度设计约为20ng/μl，其余各DNA片段终浓度设计约为10ng/μl。DNA片段含量测定：将扩增产物中低分子量的DNA片段（100bp，250bp）用DNA快速纯化试剂盒进行纯化后用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定核酸含量；其余各片段直接用超微量核酸蛋白浓度测定仪进行含量测定。少量DNAMarker配方摸索及体系放大：按预制Marker体积计算各DNA片段含量及应取样体积，取相应体积500bp以上DNA片段的PCR产物混合，按量加入已纯化的100bp，250bp的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测Marker效果，据电泳效果微调各片段的浓度，确定各扩增产物的配比。将反应体系放大到400μl。为增加DNAMarker的辨认效果，突出指示条带，标亮1000bp。按2.5%的比例加入LoadingBuffer和7.5%的甘油，混匀后用琼脂糖凝胶电泳检测DNAMarker效果，根据琼脂糖凝胶图像微调各片段的浓度，得到效果满意、条带清晰、1000bp高亮的DL2000DNAMarker。附图说明图1DL2000DNAMarker各片段PCR扩增Lane1~7分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp的扩增产物。图2DL2000DNAMarker的琼脂糖凝胶电泳Lane1~4DL2000DNAMarker。具体实施方式用实施例来说明本专利技术DNAMarker及其制备工艺实施内容。但本专利技术的内容不局限于以下实施例。实施例：制备400μlDL2000DNAMarker。（1）引物的设计在NCBI中找到SEQNo.1质粒序列（GenBank：CS054777.1）后用DNAStar-Lasergene软件进行设计引物，引物序列如表1。（2）细菌的复苏从超低温储存箱（-86℃）中取出大肠杆菌JM109(SEQNo.1），在无菌操作台上取50μl加至5ml的已加5μl氨苄青霉素（Amp）LB液体培养基试管中，放置于气浴摇床中以37℃、140r/min的温度和转速培养10-12h。（3）细菌的纯化取活化的JM109(SEQNo.1）100μl涂布于含氨苄青霉素的固体培养基上，在37℃的光照恒温培养箱中倒置培养16-18h。用已灭菌的牙签挑单菌落，放入已含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置控温气浴摇床中以37℃、140r/min培养10-12h备用。（4）质粒DNA的提取：用碱裂解法提取质粒DNA,具体步骤如下：A．将菌液转入1.5ml的Eppendorf管中，以8000r/min转速1min将细菌沉淀至管底，除尽上层培养基；B．加入100μl预冷的溶液I，放置漩涡振荡仪充分悬浮细菌，加入4μlRNase，室温放置2min。加入200μl的溶液II，快速颠倒，温和混匀，冰浴5min。再向其中加入150μl冰上预冷的溶液III，温和混本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DL2000 DNA Marker，包括： 100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp等7个不同大小DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳及染色后，各DNA条带清晰明亮，可指示DNA片段分子量大小。

【技术特征摘要】
1.一种DL2000DNAMarker，包括：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp等7个不同大小DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳及染色后，各DNA条带清晰明亮，可指示DNA片段分子量大小。2.据权利要求书1所述的DNAMarker的制备材料，其特征在于：PCR反应的模板、扩增所用引物、以载体SEQNo.1为PCR反应的模板。3.扩增所用上游引物：all-F：5’-ACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATT-3’扩增所用下游引物7条：2k-R:5’-CGAAGACCATTCATGTTGTTGCT-3’1.5k-R：5’-TCACTGCCCGCTTTCCAGT-3’1k-R：5’-GCGCCGAGACAGAACTTAATGG-3’750b-R：5’-CACCGCCGCTTTACAGG-3’500b-R：5’-CTGGCCTGGTTCACCACGCG-3’250b-R：5’-AATGGTGCATGCAAGGAGATG-3’100b-R：5’-CCTGTGGCGCCGGTGATGC-3’。4.据权利要求书1所述的DNAMarker的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：李梅，廖龙，林惠超，何利法，郑杏枝，王锐，李丹，刘立焕，
申请(专利权)人：电子科技大学中山学院，
类型：发明
国别省市：广东;44