一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组中的应用与试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组的中的应用与试剂盒。本发明专利技术提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100％，未见碱基置换或缺失(gap)。实验表明，本发明专利技术提供的引物组对SIV/SHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为100.5～1.0之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组中的应用与试剂盒。
技术介绍
艾滋病，又称为获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的一类死亡率极高的传染性疾病，对全球、尤其是亚洲和非洲等广大发展中国家人民的生命健康安全威胁极大。HIV最独特的特征之一就是基因组的高变异性。基于基因变异，流行于全球的HIV-1分为四组，M组、O组、N组和P组，M组内又可分为A～J10个亚型，各亚型间的基因离散率是20％～35％，同时，还有数十种循环重组型存在。病毒基因组基因分析在HIV研究的很多重大发现中扮演了重要角色，而且高水平的基因变异分析也是艾滋病广谱疫苗研发的重要障碍。因此，高水平的病毒基因获取技术对HIV研究至关重要。SIV(Simianimmunodeficiencyvirus)是一种猴免疫缺陷病毒，发现于非洲灵长类动物，与HIV-1病毒非常相似。SHIV(Simian-Humanimmunodeficiencyvirus)是人/猿嵌合免疫缺陷病毒，是应用分子生物学技术将HIV-1重要基因与SIV重组成的嵌合体病毒。由于恒河猴感染SIV和人感染HIV-1存在着相似性，继而发展出的症状也和AIDS相似，这些特点可以使SIV/恒河猴动物模型用于r>HIV/AIDS研究。因此，SIV、SHIV病毒基因组序列的获得及分析就显得尤为重要。起初，人们使用普通PCR(BulkPCR)扩增早期血浆病毒以获得SIV或SHIV病毒的基因组片段，然后进行Sanger测序。该方法具有简单、易操作及成本低等优势，也得到了急性期和早期病毒群体的大概复杂性。但是，由于SIV病毒或SHIV病毒的基因组序列长度较长，约为10000bp，普通的PCR技术往往存在重组、序列选择及扩增序列有限的问题，这就使扩增所获得的片段会产生一定的突变，降低了精确度，给后续序列分析造成困扰。因此，需要进一步研究能够精确扩增SIV或SHIV病毒基因组的引物。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种引物组及其在扩增SIV/SHIV基因组中的应用与试剂盒，本专利技术提供的引物特异性好，精确度高、敏感性高。本专利技术提供的引物组包括SEQIDNO:1～4所示核苷酸序列的4条引物和/或SEQIDNO:5～8所示核苷酸序列的4条引物。本专利技术提供的引物组在扩增SIV/SHIV基因组的中的应用。本专利技术提供的引物组根据SIVmac239全基因组序列(GenbankNo.M33262)保守区设计，分别位于LTR和Pol区。其中，SEQIDNO:1～4所示核苷酸序列的4条引物用于扩增SIV/SHIV基因组的5’半长(基因组全长的509位～6236位，共计5728bp)，SEQIDNO:5～8所示核苷酸序列的4条引物用于扩增SIV/SHIV基因组的3’半长(基因组全长的5244位～10087位，共计4844bp)。以本专利技术提供引物组扩增得到的5’半长和3’半长存在重复序列，经测序后能够拼接获得完整的SIVmac239全基因组序列。本专利技术提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，未见拖尾或弥散现象产生。经测序后与Genbank中登录的SIVmac239全基因组序列比对，匹配度为100％，未见碱基置换或缺失(gap)。实验表明，本专利技术提供的引物组对SIV/SHIV基因组具有良好的灵敏性，在病毒拷贝数为100.5～1.0之间皆能起到良好的检测效果，分析认为灵敏性的差异性与病毒序列变异度有关。本专利技术还提供了扩增SIV/SHIV基因组的试剂盒，包括本专利技术提供的的引物组。本专利技术提供的引物组以质粒DNA为模板，也可以动物血浆逆转录来的病毒cDNA为模板。作为优选，以病毒cDNA为模板。因此，需提取病毒RNA逆转录制备cDNA。本专利技术提供的试剂盒中还包括SEQIDNO:9所示核苷酸序列的逆转录引物。本专利技术提供的试剂盒中还包括SuperscriptIII酶和HighFidelityTaq酶。其中，SuperscriptIII酶为逆转录酶。本专利技术提供的试剂盒中还包括巢式PCR常用的缓冲液、底物，例如：PCRbuffer、Mg2+、dNTP。本专利技术提供了扩增SIV/SHIV基因组的方法，其特征在于，包括：以待测样品的cDNA为模板，以本专利技术提供的引物组扩增。在本专利技术实施例中，扩增采用巢式PCR分别扩增SIV/SHIV基因组的5’半长、3’半长。本专利技术中SIV/SHIV基因组的5’半长的扩增包括：步骤1：以待测样品的cDNA为模板，以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；步骤2：以中间产物为模板，以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIV/SHIV基因组的5’半长。退火温度(AnnealingTemperature)为引物和模板结合时候的温度参数，当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，它是影响PCR特异性的较重要因素。作为优选，步骤1中扩增的退火温度为60℃～62℃，步骤2中扩增的退火温度为60℃。优选的，步骤1中的扩增程序为：或优选的，步骤1中的扩增体系为：优选的，步骤2中的扩增程序为：优选的，步骤2中的扩增体系为：在本专利技术中，SIV/SHIV基因组的3’半长的扩增包括：步骤1：以待测样品的cDNA为模板，以SEQIDNO:5～6所示核苷酸序列的引物扩增，获得中间产物；步骤2：以所述中间产物为模板，以SEQIDNO:7～8所示核苷酸序列的引物扩增，获得SIV/SHIV基因组的3’半长。作为优选，步骤1中扩增的退火温度为64℃，步骤2中扩增的退火温度为60℃。优选的，步骤1中的扩增程序为：优选的，步骤1中的扩增体系为：优选的，步骤2中的扩增程序为：优选的，步骤2中的扩增体系为：在本专利技术中待测样品为血浆、组织、细胞或质粒。本专利技术提供了用于扩增SIV/SHIV基因组的引物组，该引物组能够有效扩增SIV或SHIV的基因组。本专利技术提供的引物组能够具有特异性的、稳定而准确的扩增出目标序列。经琼脂糖凝胶电泳检测，未见非特异性条带产生，...

【技术保护点】
一种引物组，其特征在于，包括SEQ ID NO:1～4所示核苷酸序列的4条引物和/或SEQ ID NO:5～8所示核苷酸序列的4条引物。

【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，包括SEQIDNO:1～4所示核苷酸序列的4
条引物和/或SEQIDNO:5～8所示核苷酸序列的4条引物。
2.权利要求1所述的引物组在扩增SIV/SHIV基因组的中的应用。
3.一种扩增SIV/SHIV基因组的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括SEQIDNO:9所
示核苷酸序列的逆转录引物。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括SuperscriptIII
酶和HighFidelityTaq酶。
6.扩增SIV/SHIV基因组的方法，其特征在于，包括：以待测样品的cDNA
为模板，以权利要求1所述的引物组扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增采用巢式PCR
分别扩增SIV/SHIV基因组的5’半长、3’半长。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卫，高峰，秦川，魏强，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学实验动物研究所，吉林大学，
类型：发明
国别省市：北京;11