扩增兜兰属B类MADS-box基因的引物制造技术

本发明专利技术提供了一组用于分离兜兰属B类MADS‑box基因，包括PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物以及包括所述引物的试剂盒。本发明专利技术还提供了开发上述引物的方法。本发明专利技术另外提供了利用上述引物，通过巢式PCR方法从兜兰属植物分离B类MADS‑box基因的方法。

【技术实现步骤摘要】
扩增兜兰属B类MADS-box基因的引物
本专利技术涉及生物
，尤其涉及用于扩增兜兰属B类MADS-box基因，包括PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物。具体而言，本专利技术涉及上述引物以及包括所述引物的试剂盒。本专利技术还涉及开发上述引物的方法以及利用上述引物分离B类MADS-box基因的方法。本专利技术另外涉及利用上述引物扩增得到的基因序列进行遗传关系分析的应用。
技术介绍
MADS-box基因的命名源于最初发现的四个家族成员的首字母：MCM1(MiniChromosomMaintenancel，酵母微染色体维持基因)、AGAMOUS(拟南芥轮生器官确定性基因)、DEFICIENS(金鱼草轮生器官确定性基因)和SRF(SerumResponseFactor，人血清应答因子)(NormanC等,“IsolationandpropertiesofcDNAclonesencodingSRF,atranscriptionfactorthatbindstothec-Fosserumresponseelement,”Cell,1988,55:989-1003；Passmore等,“SaccharomycescerevisiaeproteininvolvedinplasmidmaintenanceisnecessaryformatingofMATacells,”JournalofBiochemistryandMolecularBiology,1988,204:593-606；Sommer等,“GeneticcontrolofflowerdevelopmentbyhomeoticgenesinAntirrhinummajus,”Science,1990,250(4983):931-936；Yanofsky等,“TheproteinencodedbytheArabidopsishomeoticgeneagamousresemblestranscriptionfactors,”Nature,1990,346(6279):35-39)。这4种基因编码的蛋白质都有一段由56-58个氨基酸组成的位于N端的高度保守区域，将编码这类蛋白因子的基因称为MADS-box基因(Riechmann等,“MADSdomainproteinsinplantdevelopment,”BiologicalChemistry,1997,378:1079-1101)。MADS-box基因所编码的MADS-box蛋白质是一类重要的转录调控因子，其功能贯穿于整个植物发育过程，包括确定花分生组织，调节植物开花时间，调控花器官，影响果实、根、叶等器官的发育等。根据基因结构、蛋白结构和系统进化关系的不同，MADS-box基因分为TypeI和TypeII两大类型(Becker等,“ThemajorcladesofMADS-boxgenesandtheirroleinthedevelopmentandevolutionoffloweringplants,”MolecularPhylogeneticsandEvolution,2003,29(2003):464-489)。在陆生植物中，这两大类型分别被称为M型MADS-box基因和MIKC型MADS-box基因。目前从植物中分离得到的A类、B类、C类、D类、E类等同源异型基因，大部分均属于MIKCC型MADS-box家族，它们在植物花器官进化、形态多样性等方面起到关键作用。兰科植物的花具有独特的结构与形态，花器官结构呈两侧对称排布。与双子叶植物典型的花器官形态不同，兰花的三枚萼片瓣化，其中一枚花瓣高度特化形成唇瓣，雄蕊和雌蕊合生成合蕊柱。故兰花的花器官结构由外向内分为3轮：第一轮由3个萼片组成；第二轮由2个侧瓣和1个唇瓣组成；第三轮由合蕊柱组成。部分兰花的萼片和侧瓣性状极为相似，合称为花被。兰花作为重要的观赏植物，这些奇异的花型特征使其成为研究单子叶植物花发育分子机制，尤其是相关MADS-box基因表达调控机制的理想材料。在被子植物中，B类MADS-box基因分为两种类型：PI类基因和AP3类基因。这两类基因在花发育过程中共同行使B类基因的功能。现有的研究揭示了MADS-box基因在兰花成花转换及花器官发育过程中的重要作用(田敏,龚茂江,徐小雅,王彩霞,“兰科植物花发育的基因调控研究进展,”浙江农林大学学报,2011,28(3):494-499)，尤其是B类MADS-box基因亚家族在兰科植物花被片的发育中发挥重要的作用。大部分兰科植物中具有6个B类MADS-box基因，它们与其他家族基因共同决定了兰科植物复杂的花器官发育。PI类基因在兰科中可以分为两个亚类：PI-1和PI-2。而AP3类基因可以分为四个亚类：AP3B1、AP3B2、AP3A1和AP3A2(Mondragon-PalominoM等,“MADSabouttheevolutionoforchidflowers.”TrendsinPlantScience,2008,13(2):51-59)。兜兰属(PaphiopedilumPfitz)植物是兰科植物最具特色的物种之一，具有重要的观赏价值。该属包括杏黄兜兰(P.armeniacum)、同色兜兰(P.concolor)、亨利兜兰(P.henryanum)等重要的物种。在以往的研究中从蝴蝶兰、石斛兰、文心兰等兰科植物中分离得到了B类MADS-box基因。在兜兰中，只在同色兜兰等兜兰中扩增到PI-2基因，在多个兜兰中扩增到AP3A1和AP3B1基因，在一个兜兰杂交种(P.‘Macabre’)中也克隆到AP3A2，但在所有兜兰中都没有克隆到PI-1、AP3B2。我们利用文献中公布的现有引物没有克隆到兜兰的PI-1，AP3B2基因，而且也没有克隆到亨利兜兰任何B类MADS-box基因。因此，为了解析兜兰花瓣发育过程，有必要分离兜兰属B类MADS-box基因，从而可以对该类基因的序列结构、表达模式和功能进行分析，为兰科植物的遗传多样性分析以及为分子育种的实践提供理论指导。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了用于分离兜兰属B类MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物组、包含所述引物的试剂盒、开发和筛选用于分离兜兰属B类MADS-box基因的引物的方法、利用所述引物分离兜兰属B类MADS-box基因的方法、以及由上述方法分离得到的兜兰属B类MADS-box基因。本专利技术的第一方面提供了用于分离兜兰属B类MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物组，其包括下列5’→3’引物的组合：本专利技术的第二方面提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒包括本专利技术如上所述的引物组。本专利技术的第三方面提供了本专利技术所述的引物组在制备用于通过巣式PCR方法分离兜兰属B类MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的试剂盒中的用途。本专利技术的第四方面提供了一种通过巣式PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于分离兜兰属B类MADS‑box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物组，包括下列5’→3’引物的组合：

【技术特征摘要】
1.用于分离兜兰属B类MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物组，包括下列5’→3’引物的组合：和2.一种试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。3.如权利要求1所述的引物组在制备用于通过巣式PCR方法分离兜兰属B类MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的试剂盒中的用途。4.一种通过巣式PCR方法分离兜兰属B类MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的方法，所述方法使用如权利要求1所述的引物组。5.如权利要求4所述的方法，所述方法包括如下步骤：1).提取兜兰属植物的总RNA；2).采用3’RACE技术扩增得到目的基因完整的3’序列，包括：2-a).利用总RNA为模板进行第一链cDNA的合成，其中初始反应体系包括：1μl浓度为100pmol/μl的Oligo(dT)17、1μl浓度为10mM的dNTP和11μlmRNA；2-b).利用步骤2-a)所得的cDNA为模板，采用巣式PCR的方法，进行3'RACE第一轮PCR反应和3'RACE第二轮PCR反应，以扩增目的基因片段，其中涉及的引物如下：其中，3'RACE第一轮PCR反应体系如下：其中F1分别是上述AP3A1_F1、AP3A2_F1、AP3B1_F1、AP3B2_F1或PI_F1，其中，3'RACE第二轮PCR反应体系如下：其中F2分别是上述AP3A1_F2、AP3A2_F2、AP3B1_F2、AP3B2_F2或PI_F2；3).采用5’RACE技术扩增得到目的基因完整的5’序列，包括3-a).使步骤1)的RNA脱磷酸、去帽、并进行连接反应：3-b).利用步骤3-a)得到的已进行连接反应的RNA为模板，进行第一链cDNA的合成，其中初始反应体系包括：1μl浓度为50μM的GeneRacerOligodT引物、1μl浓度为10mM的dNTPMix和1μlDEPCH2O；3-c).利用步骤3-b)所得的cDNA为模板，采用巣式PCR的方法，进行5'RACE第一轮PCR反应和5'RACE第二轮PCR反应，以扩增目的基因片段，其中涉及的引物如下：其中，5'RACE第一轮PCR反应体系如下：其中R1分别是上述AP3A1_R1、AP3A2_...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾瑞冬，周妍慧，葛红，杨树华，赵鑫，徐玉凤，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11