H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。试剂盒分别设计了PCR引物和TaqMan荧光探针,引物包括引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组包括探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。本发明专利技术的检测方法包括：标本处理，RNA核酸提取，RT‑PCR扩增反应及荧光信号检测，采用PCR及TaqMan荧光探针技术能对疑似人感染H10N7禽流感感染者标本H10N7的特异性核酸序列进行基因扩增并检测，从而判断H10N7的感染情况。本发明专利技术充分利用了PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束时便可根据扩增曲线判定是否为H10N7禽流感病毒感染。

【技术实现步骤摘要】
H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于体外诊断试剂
，具体涉及一种H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因组分为8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纤突，分别具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的活性。这两个基因是病毒的特异性抗原，根据HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。其病原体AIV为单股负链分节段的RNA病毒，其中血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是两个比较重要的基因节段，Susan等{Baigent,SusanJ.,andJohnW.McCauley.“Glycosylationofhaemagglutininandstalk-lengthofneuraminidasecombinetoregulatethegrowthofavianinfluenzavirusesintissueculture.”Virusresearch79.1(2001):177-185.}的研究表明HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。荧光定量PCR技术具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点，多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。当今呼吸道传染病在全球范围内广泛传播与流行，新的病种不断被发现，流行地域不断扩展，流行的频率不断增强，人感染H10N7禽流感病毒输入的危险性日益增高，对国境口岸的卫生安全造成了严重威胁，因此对呼吸道传染病的监测是国境口岸卫生检疫的重要工作。目前，针对H10N7亚型一步法实时荧光定量RT-PCR方法未见报道，因此，本领域技术人员有必要提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的人感染H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
技术实现思路
针对上述现有技术中的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。为实现上述目的之一提供一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，本专利技术采用了以下技术方案：一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，包括：(1)RNA提取试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；(2)引物组和探针组；引物组有引物1至4，分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，分别具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列，所述引物和探针序列如下：所述的特异性引物为：引物1为H10正向引物：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’(SEQIDNo.01所示)；引物2为H10反向引物：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’(SEQIDNo.02所示)；引物3为N7正向引物：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’(SEQIDNo.O4所示)；引物4为N7反向引物：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’(SEQIDNo.O5所示)；所述的特异性探针为：探针A为H10探针：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’(SEQIDNo.O3所示)；探针B为N7探针：5’-VIC-ATACCACAAATGTGACGACA-3’(SEQIDNo.O6所示)。所述探针A中的“FAM”和探针B中的“VIC”表示现有技术中所采用的荧光报告基团。优选的，所述RNA提取试剂包括裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、洗涤液一、洗涤液二和洗脱液；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、引物3、引物4、探针A、探针B、逆转录酶、DNA聚合酶、RNase抑制剂；；阳性对照品采用H10N7阳性对照，阴性对照品采用DEPCH2O。本专利技术的目的之二是提供一种H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，包括如下检测步骤：S1、标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取；S2、RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用磁珠法进行核酸提取；S3、RT-PCR扩增反应：RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探针混合液，逆转录酶，DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水，RT-PCR质控品，标本RNA核酸；其中，所述的特异性引物和探针是针对HA和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计,能够区别其他病毒株；所述的特异性引物为：H10-F：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’(SEQIDNo.01所示)；H10-R：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’(SEQIDNo.02所示)；N7-F：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’(SEQIDNo.O4所示)；N7-R：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’(SEQIDNo.O5所示)；所述的特异性探针为：H10-P：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’(SEQIDNo.O3所示)；N7-P：5’-VIC-ATACCACAAATGTGACGACA-3’(SEQIDNo.O6所示)；将上述混合好的反应液进行PCR扩增及荧光信号检测；S4、结果判定：对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若RT-PCR反应产物的荧光检测结果呈阳性，则待测样品含有H10N7禽流感病毒。优选的，步骤S2中所述的RNA提取采用病毒RNA提取试剂盒提取，取140ul标本，按照试剂盒说明书中的操作步骤提取RNA，最后用60ul洗脱液洗脱RNA。优选的，步骤S3中所述的RT-PCR反应体系为：RT-PCR反应液10.0μl,引物探针混合液2.75μl，逆转录酶0.2μl，DNA聚合酶0.2μl,RNase抑制剂0.4μl，DEPCH2O6.45μl,标本核酸5.0μl。优选的，步骤S3中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min；95℃变性2min；95℃变性5s，60℃退火和延伸60s，40个循环。优选的，所述探针H10-P的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；所述探针N7-P的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。优选的，步骤S3中所述的引物H10-F、引物H10-R、探针H10-P、引物N7-F、引物N7-R和探针N7-P的摩尔比为3：3：3：2：2：2。优选的，步骤S3中RT-PCR反应体系的特异性正、反向引物和探针的浓度均为10μM，正向引物分别为H10-F、N7-F，反向引物分别为H10-R、N7-R。本专利技术的有益效果在于：本专利技术试剂盒和检测方法针对H10N7病毒的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，其特征在于包括：(1)RNA提取试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；(2)引物组和探针组；引物组有引物1至引物4，分别对应具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，分别对应具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，其特征在于包括：(1)RNA提取试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；(2)引物组和探针组；引物组有引物1至引物4，分别对应具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，分别对应具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述RNA提取试剂采用病毒RNA提取试剂盒；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、引物3、引物4、探针A、探针B、逆转录酶、DNA聚合酶、RNase抑制剂；所述阳性对照品采用H10N7阳性对照，阴性对照品采用DEPCH2O。3.一种H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于包括如下检测步骤：S1、标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取；S2、RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用磁珠法进行核酸提取；S3、RT-PCR扩增反应：RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探针混合液，逆转录酶，DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水,RT-PCR质控品,标本RNA核酸；其中，所述的特异性引物和探针是针对HA和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计,能够区别其他病毒株；所述的特异性引物为：H10-F：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’SEQIDNo.01；H10-R：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’SEQIDNo.02；N7-F：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’SEQIDNo.O4；N7-R：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’SEQIDNo.O5；所述的特异性探针为：H10-P：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’SEQIDNo.O3；N7-P：5’-VIC-A...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐赛涛，吴勇聪，温小媛，陶瑞，
申请(专利权)人：解码上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31