区分clade 2．3．2．1和clade 7．2 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物制造技术

本发明专利技术提供了一组区分clade 2.3.2.1和clade 7.2 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物，利用clade 2.3.2.1和clade 7.2 H5 AIV血凝素基因（HA）特征性核苷酸序列存在GC含量差异来设计。利用本组引物对clade 2.3.2.1和clade 7.2 H5 AIV进行实时荧光定量PCR反应均可有效扩增，但其在clade 2.3.2.1和clade 7.2 H5 AIV的实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线存在熔解温度（Tm值）差异来对clade 2.3.2.1和clade 7.2 H5 AIV进行有效区分。配合和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑并利用仪器自带的分析软件，可达到仅需一组引物，即可特异性的对clade 2.3.2.1和clade 7.2 H5 AIV感染情况进行鉴别诊断。本发明专利技术鉴定方法简单，效率和准确率较高。

【技术实现步骤摘要】
区分clade2．3．2．1和clade7．2H5AIV的实时荧光定量PCR引物
本专利技术属于动物传染病学领域，具体涉及一组区分clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的实时荧光定量PCR引物。
技术介绍
禽流感（Avianinfluneza，AI）是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病。高致病性H5亚型禽流感病毒（H5subtypeavianinfluenzavirus,H5AIV）引起的感染目前被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，在我国被列为一类动物疫病。关于流感的最早记录可追溯到1878年来自意大利的一次报道，随后世界各地陆续发生流感的暴发和流行。1996年，在我国分离到的第一株H5N1亚型HPAIV（A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），GS/GD/96），紧接着香港于1997年发生H5N1亚型禽流感病毒直接感染人事件，这是第一个禽源流感病毒未经中间宿主而直接感染人的证据。由于从祖源病毒GS/GD/96进化出多个谱系且命名不统一，为此WHO、FAO和OIE联合制定了H5N1HPAIV统一分类准则将H5N1HPAIV分为0~9共计10个不同clade。其中clade2.3.4最早于2003~2006年间流行于中国、越南、泰国、老挝和马来西亚等地的病毒株，2006~2009年clade2.3.4分支在我国很多地区是优势流行株，而2010年后逐渐被clade2.3.2.1分支取代，针对clade2.3.2.1禽流感病毒的流行，我国研制了Re-6株疫苗；随后clade7.2也陆续增多并研制Re-7株疫苗。然而clade7.2与clade2.3.2.1禽流感病毒共流行的现象时有发生。对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV进行鉴别诊断有助于指导H5AIV相应疫苗的科学使用。由于clade2.3.2.1和clade7.2二者之间的HA基因序列核苷酸同源率高达90.4%（以经典毒株的同源率为例），很难通过常规的分子生物学方法（如常规RT-PCR方法）进行鉴别。本专利技术的一组区分clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的实时荧光定量PCR引物仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV进行有效区分。该引物根据clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV血凝素基因（HA）所存在的特征性核苷酸序列差异来设计；利用实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线的Tm值和其GC含量正相关的特点，通过观察clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV经该组引物进行实时荧光定量PCR扩增反应后的熔解曲线Tm值差异，即可精确对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV感染情况进行准确鉴别诊断，相关研究尚未见国内外文献报道，本专利技术可填补相关领域空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组区分clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的实时荧光定量PCR引物及其应用，该引物能有效区分clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV感染（或共感染），为科学防控H5AIV提供技术保证。本专利技术根据clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV血凝素基因（HA）存在特征性的核苷酸序列差异来设计一组实时荧光定量PCR引物。利用该扩增区域clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV血凝素基因（HA）存在的核苷酸GC含量差异，通过建立基于EvaGreen的实时荧光定量PCR方法对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV血凝素基因（HA）进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值）差异，根据熔解曲线Tm值差异可直接对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV感染情况进行鉴别诊断。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组区分clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的实时荧光定量PCR引物，其核苷酸序列为：上游引物F1：5’-TTCTTCTGGACAATTTTAAA-3’；下游引物R1：5’-TGCAGTTACCATATTCCA-3’。通过所述引物建立基于EvaGreen的实时荧光定量PCR方法，根据该引物扩增的clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV血凝素基因（HA）所存在的核苷酸特征性差异——GC含量差异，可导致实时荧光定量PCR反应扩增反应后的生成的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值）的特点，可直接对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV感染进行鉴别。具体包括以下步骤：（1）设计并合成上述特异性引物对F1/R1（2）病毒RNA提取：从检测样品中分别提取clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的RNA；（3）RT-PCR扩增：设计并合成H5AIV血凝素基因HA特异性引物对H5-HAF/H5-HAR对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增，获得其HA基因序列；将RT-PCR扩增的目的片段进行胶回收并纯化后，克隆到T载体上，获得含有clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的血凝素基因HA的阳性重组质粒（T-clade2.3.2.1-1和T-clade7.2-1），测定其OD值计算出拷贝数后，连续倍比稀释，作为实时荧光定量PCR反应的标准品。所用H5AIV血凝素基因HA特异性引物对H5-HAF/H5-HAR的核苷酸序列为：H5-HAF:5’-TGGTTACCATGCAAACAAC-3’；H5-HAR:5’-TTACACTTTCCATACATTCATTATC-3’。（4）实时荧光定量PCR：用所述实时荧光定量引物F1和R1对含有clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的血凝素基因HA的阳性重组质粒（T-clade2.3.2.1-1和T-clade7.2-1）进行EvaGreen实时荧光定量PCR扩增，反应完成后获得相应的扩增曲线，并生成EvaGreen实时荧光定量PCR扩增的熔解曲线。（5）病毒感染情况判断：实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察扩增曲线判断是否存在clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV感染；通过观察熔解曲线其Tm值差异可对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV进行鉴别。其中，设计的实时荧光定量PCR引物需满足如下要求：（1）特异性强：该实时荧光定量PCR产物需选择clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV血凝素基因HA核苷酸序列进行分析后保守的区域设计，对二者均具有高特异性，达到仅需一组引物能对clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV进行扩增的目的。即观察实时荧光定量PCR反应后的扩增曲线即可判断是否感染clade2.3.2.1或clade7.2H5AIV。（2）两种病毒的扩增区域GC含量不同：该组引物对扩增的血凝素基因HA在clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV中存在GC含量差异。基于实时荧光定量PCR反应生成的熔解曲线的Tm峰值差异（该差异和核苷酸序列的GC含量差异正相关），即可通过观察实时荧光定量PCR反应后的熔解曲线对clade2.3.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组区分clade 2.3.2.1和clade 7.2 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物的核苷酸序列为：上游引物F1：5’‑ TTCTTCTGGACAATTTTAAA ‑3’；下游引物R1：5’‑ TGCAGTTACCATATTCCA ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一组区分clade2.3.2.1和clade7.2H5AIV的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物的核苷酸序列为：上游引物F1：5’-TTCTTCTGGACAATTTTAAA-3’；下游引物R1：5’-TG...

【专利技术属性】
技术研发人员：施少华，万春和，陈珍，黄瑜，程龙飞，傅光华，陈红梅，傅秋玲，刘荣昌，陈翠腾，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35