一种用于诊断膀胱癌的定量PCR引物和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于诊断膀胱癌的定量PCR引物和试剂盒，所述引物包括上游引物和下游引物，其序列均是人TUC338基因上的核苷酸序列，用于扩增人TUC338基因。本发明专利技术人发现TUC338基因与膀胱癌相关，因此针对TUC338基因，可以设计引物，用于定量扩增TUC338基因，根据TUC338基因的扩增量来确定膀胱癌的发生情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及膀胱癌诊断
，尤其涉及一种用于诊断膀胱癌的定量PCR引物和试剂盒。
技术介绍
长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的RNA分子，它可在多层面上(如表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达。lncRNA最初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，是一种“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表面，lncRNA参与了X染色体沉默、染色体修饰和基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程，其调控作用正在被越来越多的人研究。近年来研究表明lncRNA有助于肿瘤的早期诊断、预后的判断并且可以作为分子靶向治疗的目标基因，因此具有较好的临床应用价值。诱导性基因表达系统可以从时间上调控基因的表达，是基因功能研究的重要工具之一，其中，四环素诱导的基因表达系统是应用最广泛的一种，并且在合成生物学的发展历程中作为一种工具被广泛应用。由于四环素诱导的基因表达系统可以从时间上控制基因的表达，为膀胱癌的诊断与治疗带来了新的思路。TUC338(GeneID:102157401，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝TUC338)在肝癌、舌癌等癌中起着重要的作用，但是该基因与膀胱癌的关系未见报道。
技术实现思路
本专利技术发现TUC338基因与膀胱癌相关，因此本专利技术提供一种用于诊断膀胱癌的定量PCR引物和试剂盒，能够实现膀胱癌的诊断。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种用于诊断膀胱癌的定量PCR引物，包括上游引物和下游引物，其序列均是人TUC338基因上的核苷酸序列，用于扩增人TUC338基因。本专利技术发现了TUC338基因与膀胱癌相关，因此根据PCR的原理，可以设计针对该基因的引物，用于扩增该基因，以定量分析该基因的表达水平，从而用于诊断膀胱癌的发生。进一步地，上述上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。使用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物进行定量PCR扩增，能够显著地区分膀胱癌患者和健康人中TUC338基因的表达量。根据本专利技术的发现，用于扩增TUC338基因的引物不限于SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，然而专利技术人发现SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物对于区分膀胱癌患者和健康人具有显著优异的效果，因此是优选的引物对。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种用于诊断膀胱癌的定量PCR试剂盒，该试剂盒包括定量PCR引物，上述引物包括上游引物和下游引物，其序列均是人TUC338基因上的核苷酸序列，用于扩增人TUC338基因。进一步地，上述上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。进一步地，上述试剂盒还包括作为内参的引物。进一步地，上述作为内参的引物，包括上游引物和下游引物，其序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。进一步地，上述试剂盒还包括DNA聚合酶。进一步地，上述DNA聚合酶是TaqDNA聚合酶。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供分离的人TUC338基因在制备用于诊断膀胱癌的定量PCR引物中的用途。根据本专利技术的第四方面，本专利技术提供如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物对在作为诊断膀胱癌的定量PCR引物中的用途。经研究，本专利技术人发现TUC338基因与膀胱癌相关，因此针对TUC338基因，可以设计引物，用于定量扩增TUC338基因，根据TUC338基因的扩增量来确定膀胱癌的发生情况。附图说明图1：TUC338在膀胱癌组织中的表达水平。使用定量PCR方法检测膀胱癌组织中TUC338的相对集中度。图2：TUC338在细胞系中的表达水平。与SV-HUC-1细胞系对比，TUC338在T24(A)及5637(B)均显著性高表达(*P<0.01)。图3：si-TUC338敲减TUC338的表达量。与si-NC组对比，TUC338表达水平在si-TUC338组中表达水平显著性下降(P<0.01)。图4：四环素诱导TUC338shRNA敲减TUC338的表达量。加入不同浓度强力霉素(DOX)后四环素诱导组的TUC338表达水平下降；1μg/ml强力霉素能够最大程度的抑制TUC338的表达水平(P<0.01)。图5：CCK8法检测转染siRNA质粒抑制细胞增殖的结果。与si-NC组对比，在si-TUC338组中，T24细胞(图A)及5637细胞(图B)的增殖被显著性抑制(P<0.01)。图6：CCK8法检测转染四环素诱导shRNA质粒抑制细胞增殖的结果。与对照组相比，在加入1μg/ml强力霉素诱导的TUC338shRNA组中，T24细胞(图A)及5637细胞(图B)的增殖被显著地抑制(P<0.01)。图7：ELISA法检测转染siRNA质粒后细胞凋亡情况的结果图。转染si-TUC338后，半胱天冬酶3(Caspase-3)在T24(图A)及5637(图B)均显著性提高(P<0.05)。图8：ELISA法检测转染四环素诱导shRNA质粒细胞凋亡情况的结果图。转染四环素诱导TUC338shRNA后，半胱天冬酶3在T24(图A)及5637(图B)均显著性提高(P<0.01)。图9：四环素诱导系统质粒psi-LVRInU6TGP的图谱。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。实验方法：1.标本的收集膀胱癌及其配对的癌旁正常组织标本收集于安徽医科大学第一附属医院行全膀胱手术切除的膀胱癌患者标本。每例患者均签署知情同意书。2.细胞培养两种膀胱癌细胞系T24和5637以及正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1均购自中科院上海生科院。膀胱癌(人)细胞5637、T24和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1分别培养于1640、DMEM和F-12K培养基(含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素混合液)，放置于37℃、5％CO2的培养箱培养，贴壁细胞在长满瓶底时，用0.25％胰蛋白酶消化后按比例进行传代培养。3.四环素诱导的针对TUC338的短发夹RNA(shRNA)质粒构建四环素诱导系统质粒psi-LVRInU6TGP购于广州富能基因公司(FulenGen，广州，中国)，其图谱如图9所示。将针对TUC338的shRNA序列插入到四环素诱导系统的下端。针对TUC338的shRNA序列是GCCCAATTGTGCAGTGTGAAA(SEQIDNO:1)；针对阴性对照NCshRNA的序列为TTCTCCGAACGTGTACGTTT(SEQIDNO:2)。4.细胞瞬时转染si-TUC338序列为GCCCAATTGTGCAGTGTGAAA(SEQIDNO:1)；阴性对照si-NC序列为TTCTCCGAACGTGTACGTTT(SEQIDNO:2)。将细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后进行转染，方法参考转染试剂LipofectamineTM2000说明书。转染6h后，用移液枪吸弃每孔培养液，每孔再加入新的培养基500μl，减少Lipofectamine2000对细胞的毒性。5.实时荧光定量PCR采用试剂盒PremixExTaqTMII本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断膀胱癌的定量PCR引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其序列均是人TUC338基因上的核苷酸序列，用于扩增人TUC338基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断膀胱癌的定量PCR引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其序列均是人TUC338基因上的核苷酸序列，用于扩增人TUC338基因。2.根据权利要求1所述的定量PCR引物，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。3.一种用于诊断膀胱癌的定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量PCR引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其序列均是人TUC338基因上的核苷酸序列，用于扩增人TUC338基因。4.根据权利要求3所述的定量PCR试剂盒，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟丽莎，朱书，蔡志明，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44