一种检测鲑鱼甲病毒的TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测鲑鱼甲病毒的TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明专利技术首先提供了用于检测鲑鱼甲病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术还提供了使用上述引物和探针进行TaqMan荧光定量PCR检测鲑鱼甲病毒的方法。研究表明，使用本发明专利技术的试剂盒检测鲑鱼甲病毒，具有简便、快速、准确、灵敏度高、特异性好等优点，可用于鲑鱼甲病毒六个基因型的检测，本发明专利技术的提出为鲑鱼甲病毒的检测提供了一种有效的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种检测鲑鱼甲病毒的TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用
本专利技术涉及用于病毒检测的引物和试剂盒，特别是涉及用于检测鲑鱼甲病毒的特异性的荧光定量PCR引物和探针，本专利技术还涉及利用该引物和探针进行鲑鱼甲病毒检测的方法和试剂盒。本专利技术属于病毒检测

技术介绍
鲑鱼甲病毒(salmonidalphavirus，SAV)隶属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)，主要感染大西洋鲑(salmosalar)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和褐鳟(SalmotruttaL.)等鲑科鱼类引起胰脏病、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1％～48％，并在水产养殖的各个阶段均有爆发。1995年Nelson等在爱尔兰首次从患胰脏病的大西洋鲑和虹鳟体内分离出该病毒，1997年Castric等又在法国从患昏睡病的大西洋鲑和虹鳟体内分离到SAV，目前该病广泛流行于英格兰、苏格兰、挪威、法国、波兰、意大利和西班牙等欧洲国家，据统计从1995年至2007年发病率逐年增加高达90％，每年由此疫病造成巨大的经济损失。2013年鲑鱼甲病毒感染被列入OIE水生动物疫病名录中。虽然，我国目前尚未有文献报道检测到该病毒，但是，随着近年我国对鲑科鱼类进口和鲑科鱼类卵引进的增加，该病传入我国的风险也日益增大。因此，我国建立SAV快速诊断和测检方法是紧迫的任务。目前已发现六个基因型(SAV1、SAV2、SAV3、SAV4、SAV5、SAV6)。其中，SAV1、SAV3、SAV4、SAV5、SAV6可感染大西洋鲑引起胰腺病(Salmonpancreasdisease，PD)；SAV2可感染虹鳟引起睡病(Sleepingdisease，SD)。SAV病毒粒子具有囊膜，大小为65nm。单股正链RNA病毒，基因组长11-12kb，且含有两个开放阅读框(ORF)。基因组的第二个ORF编码26S子基因的mRNA，最终产生5个结构蛋白，即衣壳蛋白、E3、E2、6K、和E1共同构成了病毒的囊膜糖蛋白。E2在未成熟时，与E3相连，组成E2的前体，E3的作用相当于E2的信号肽。当E2成熟时，E2与E3分离，E2被转运到病毒粒子表面。近年来，我国一些地方，特别是北方地区，大规模发展了冷水鱼类(如：虹鳟)养殖，且取得了巨大的经济效益。虽然我国目前尚未发现该病毒，但是随着近年我国对鲑科鱼类进口的增加，该病传入我国的风险也日益增大，因此有必要尽早建立对鲑鱼甲病毒快速灵敏的检测方法，防止该病传入我国，SAV的有效预报或者诊断是我们必须解决的问题。核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为鲑鱼甲病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于检测鲑鱼甲病毒的特异性引物和探针。本专利技术的另一个目的在于提供检测鲑鱼甲病毒的TaqMan荧光定量PCR方法及其试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术对已知鲑鱼甲病毒基因序列进行比对，筛选出鲑鱼甲病毒六个基因型保守区序列，即E2蛋白基因中一段保守序列(9297-9476bp)。针对该序列本专利技术专利技术人经反复筛选和验证，得到一对用于检测鲑鱼甲病毒六个不同基因型的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的探针，可扩增得到的片段大小为179bp(SEQIDNO.1所示)，所述引物的序列如下：上游引物：5’-TTACGACGGTGCTAATCTCTAC-3’(SEQIDNO.2)下游引物：5’-ACCAAGTAACGGAGAAGTTCAC-3’(SEQIDNO.3)所述探针序列为：5’-FAM-AATCGGCAGAGCGTCATACACATCAAC-BHQ1-3’(SEQIDNO.4)。其中，所述探针序列的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭基团。在本专利技术中，优选的，所述报告荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，所述试剂盒还包括TaqMan荧光定量PCR扩增缓冲液，优选的，所述TaqMan荧光定量PCR扩增缓冲液为PremixExTaqMasterMix。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，所述的试剂盒中还包括总RNA提取试剂、反转录试剂、阳性对照和阴性对照，所述的阳性对照为含有鲑鱼甲病毒E2基因的重组质粒标准品，所述的阴性对照为去离子水。进一步的，本专利技术还提出了使用本专利技术所述的TaqMan荧光定量PCR试剂盒检测鲑鱼甲病毒时，包括以下步骤：(1)将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80℃，备用；(3)以步骤(2)得到的总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；(4)PCR反应结束后，根据扩增动力学曲线判断结果。其中，优选的，PCR扩增反应体系为：2×PremixExTaqMasterMix12.5μl，浓度为10μM的上游引物及下游引物各0.5μl，探针1μl，模板2μl，去离子水8.5μl。其中，优选的，实时荧光定量PCR的反应程序为：(1)95℃预变性30s；(2)95℃变性5s、60℃退火30s，共40个循环。其中，优选的，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：Ct值≤40.0时样品结果为阳性；Ct值＞40.0的样品结果为阴性。更进一步的，本专利技术还提出了所述的TaqMan荧光定量PCR试剂盒在制备检测鲑鱼甲病毒的试剂中的应用，其中，优选的，所述的鲑鱼甲病毒包括以下六个基因型：SAV1、SAV2、SAV3、SAV4、SAV5以及SAV6。相较于现有技术，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提供了用于检测鲑鱼甲病毒TaqMan荧光定量PCR试剂盒，建立了检测鲑鱼甲病毒病毒的TaqMan荧光定量PCR方法，该方法可用于六个基因型的鲑鱼甲病毒的检测；(2)使用本专利技术所述的试剂盒检测的鲑鱼甲病毒具有很高的检测灵敏度，可以检测到15个拷贝的鲑鱼甲病毒cDNA；且特异性强，其重复性好，可提高鲑鱼甲病毒六个基因型检测的阳性率；(3)使用本专利技术所述的试剂盒检测的鲑鱼甲病毒，操作简单，检测过程仅需90分钟，大大缩短了检测周期；(4)使用本专利技术所述的试剂盒检测的鲑鱼甲病毒，其检测结果使用荧光定量PCR仪直接观察，不存在溴化乙锭污染的问题，该试剂盒的推广应用将为防治和监测鲑鱼甲病毒病提供了一种新的技术手段。附图说明图1为鲑鱼甲病毒TaqMan荧光定量PCR扩增动力学曲线；图2为鲑鱼甲病毒TaqMan荧光定量PCR标准曲线；图3为普通PCR方法检测本专利技术建立引物的灵敏性核酸电泳图；图4为普通PCR方法检测OIE批准的用于检测鲑鱼甲病毒引物的灵敏性核酸电泳图；图5为鲑鱼甲病毒TaqMan荧光定量PCR的特异性试验扩增动力学曲线。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1鲑鱼甲病毒六个基因型特异性引物和探针的设计根据Genebank中发表的鲑鱼甲病毒E2基因序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测鲑鱼甲病毒的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示的引物以及核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的探针，所述探针序列的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鲑鱼甲病毒的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQIDNO:2～3所示的引物以及核苷酸序列为SEQIDNO:4所示的探针，所述探针序列的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭基团。2.根据权利要求1所述的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述报告荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。3.根据权利要求1所述的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括TaqMan荧光定量PCR扩增缓冲液。4.根据权利要求3所述的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述TaqMan荧光定量PCR扩增缓冲液为PremixExTaqMasterMix。5.根据权利要求1-4任一项所述的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括总RNA提取试剂、反转录试剂、阳性对照和阴性对照，所述的阳性对照为含有鲑鱼甲病毒E2基因的重组质粒标准品，所述的阴性对照为去离子水。6.如权利要求1-5任一项所述的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，用于检测鲑鱼甲病毒时，包括以下步骤：(1)将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；(2)以步骤(1)得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘敏，李一经，施文，唐立杰，徐义刚，宋傲臣，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23