一种用于检测传单患者EB病毒FISH检测探针制造技术

本发明专利技术涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种用于检测传单患者EB病毒FISH检测探针；所述探针为EB病毒BamHI‑W片段经过标记得到；所述BamHI‑W片段的核苷酸序列为EBV基因组13232‑16189所示。该探针灵敏度和特异性较常规的传单检测方法检测EBV的病毒拷贝数都要高，而且病毒的细胞内定位准确，也能非常直观的判断病毒载量。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测传单患者EB病毒FISH检测探针
本专利技术涉及医学诊断
，具体而言，涉及一种用于检测传单患者EB病毒FISH检测探针及其制备方法。
技术介绍
自从1964年Epstein和Barr等在淋巴瘤细胞系中发现了EB病毒颗粒以来，人们对EBV的认识进入了崭新的阶段。EBV与人类多种感染性疾病如传染性单核细胞增多症、慢性活动性EBV感染、EBV相关的噬血细胞增多综合征、移植后淋巴组织增生症及淋巴瘤、鼻咽癌及胃癌等多种恶性肿瘤密切相关。传染性单核细胞增多症(infectiousmononucleosis,IM)是一种急性全身淋巴细胞增生性疾病，常在儿童期或青春期初期感染较大量的EBV时发病，主要由飞沫与唾液经呼吸道传播，其次通过密切接触传播，潜伏期约40天。IM的典型特征包括不规则发热，咽喉炎，淋巴结肿大，全身乏力，以及外周血非典型淋巴细胞增多。脾肝肿大，黄疸和脾破裂等并发症十分罕见。其病程通常持续数天至数周，临床常认为其呈自限性。有文献称，近年来EBV感染儿童逐年增多，夏秋较冬春季节常见，且半数儿童感染EBV后表现为IM，且临床表现趋于多样化。一般情况下IM以抗病毒及对症支持治疗为主，预后较好。但少数IM患儿临床表现呈爆发性过程，出现严重并发症，累及全身多个系统并造成多脏器损害，临床称为重症IM(severeinfectiousmononucleosis,SIM)或致死性IM(fatalinfectiousmononucleosis，FIM)，其中约80％FIM可进一步进展为EBV-AHS。然而目前国内对于重症IM并没有统一认识及诊断标准，临床上主要依据患者症状轻重以及并发症来判断其病情轻重程度，以便与普通IM区分。有研究认为IM患者有2个系统以上受损即可诊断为重症IM，曾有学者进行过统计分析发现重症IM如不及时治疗死亡率高达92.3％。所以如何及时并且准确诊断SIM，对于病人的治疗及预后十分关键。因EBV的分离相对困难，所以临床一般采用血清学方法作辅助诊断。但当机体免疫低下时，则很难用血清学结果分析，所以在EBV感染中应用分子诊断学方法十分必要。目前常见EBV的临床检测项目有外周血涂片进行异型淋巴细胞计数、嗜异性凝集试验、EBV抗体检测(包括EBV-VCA-IgM，EBV-VCA-IgG)、PCR检测EBV-DNA。外周血涂片异淋计数以及嗜异性凝集试验均为非特异性试验。多数IM患者异淋计数超过10％，但除EBV外的其他病毒如巨细胞病毒(cytomegalovirus)、登革病毒(Denguevirus)等，或某些药物感染也可引起同样反应。嗜异性凝集试验在起病后1-2周可出现阳性，3-4周达到高峰，阳性率据称80％以上，但是少数病例该实验结果始终阴性。另外感染过程的早期常出现嗜异性凝集试验假阴性。EBV-VCA-IgM是IM急性期重要的诊断指标，出现在EBV感染早期，通常在4-6周消失，所以此项指标与病人入院时间有密切关系，加之实验结果也常受到实验人员操作方式、诊断试剂盒检出率的影响，常常不能准确反应病人情况。EBV-VCA-IgG出现在EBV感染的急性期，发病后2-4周达到高峰，略微下降后持续终生，所以这一指标目前多用于流行病学统计。临床上常用且较为可靠的指标仅有PCR检测EBV-DNA结果。PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，由Mullis首次报道，通过体外扩增可以将目的基因片段百万倍地放大，从而极大地提高核酸分子检测的灵敏度。PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、简便快速、易自动化以及产率高等优点。但正由于PCR使DNA拷贝数呈指数增长，所以极微量的模板污染就可以造成假阳性出现。其次在标本采集、运输及处理过程中也易发生污染。另假阴性也是其反应过程中易出现的一个不可忽视的问题，这类问题大多数与标本处理、PCR试剂过期或PCR仪器故障有关。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针，以解决上述问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针，所述探针为EB病毒BamHI-W片段经过标记得到；所述BamHI-W片段的核苷酸序列为EBV基因组13232-16189所示。目前传染性单核细胞增多症患者(以下简称传单患者)EB病毒的临床诊断方法主要有病毒培养、抗体检测及核酸检测等；EBV培养是患者标本接种至新鲜的人B细胞或脐血淋巴细胞中，4周后可通过荧光抗体染色技术检测EBV抗原。但EBV分离鉴定耗时长而且需要特殊的组织培养条件，因而不适宜常规检测所采用。目前EBV培养主要应用于对EBV感染的发病机制、预防、治疗的体外研究。抗体检测是用免疫荧光法、免疫酶法或ELISA法检测EBV抗体有助于EBV感染的诊断。其中ELISA法是目前最常用的检测EBV的方法。此方法操作简单、快速，试验结果应用酶标仪读数，准确性较高，在临床得到广泛应用。急性初次EBV感染的特点是可检测到早期抗原VCAIgM抗体、VCAIgG及VCAIgA。此方法的缺点是特异性较差，抗体产生存在窗口期及操作稳定性欠佳等。核酸检测主要有EBVPCR扩增法，具有较高敏感性和特异性。EBV-PCR有常规PCR、巢式PCR、多重PCR、逆转录PCR和实时PCR等。PCR从DNA水平检测，其敏感度比病毒培养及抗体检测高，但PCR检测成本高且其特异性略差，结果易受各种不确定因素影响，易出现假阳性或假阴性，有时需要多次重复才能得出可靠结果。以前国内外的报道中从未有相关研究报道过利用FISH技术检测传单患者EBV的方法在临床检测中的应用，因此如果在临床中得以应用及推广无疑会在国内外处于领先水平。优选的，如上所述的FISH检测探针，所述标记采用Biotin-dUTP标记。在相关酶(例如Klenow酶)的催化下，通过随机引物标记反应(randomprimelabeling)可以把生物素标记的Biotin-dUTP掺入到新合成的DNA探针中，这样就可以产生生物素标记的DNA探针。在随机引物标记反应过程中，一些标记好的DNA探针可以被酶从模板DNA链上驱赶下来。这样在模板量较少的情况下，通过随机引物标记反应，最后可以产生比模板DNA量更多的生物素标记DNA探针，可多达1-15倍左右。更优选的，所述标记可采用Biotin-16-dUTP或Biotin-11-dUTP。一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针的制备方法，包括：培养EB病毒并提取EB病毒DNA作为模板，PCR扩增EB病毒BamHI-W片段，对所述BamHI-W片段进行标记得到标记产物；纯化所述标记产物后得到EB病毒FISH检测探针。优选的，如上所述的制备方法，培养EB病毒所用的宿主细胞为P3hr-1细胞；更优选的，病毒悬液的制备过程包括：培养P3hr-1细胞，待细胞生长至融合度85～95％，收集培养液，冻于-70～90℃，过夜。次日，水浴融化，再放于-70～90℃冰箱，反复冻融2～4次。0～6℃，2500～3500rpm离心15～25min，将上清用0.4～0.5μm滤器过滤；用Millipore浓缩柱4500～55本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针，其特征在于，所述探针为EB病毒BamHI‑W片段经过标记得到；所述BamHI‑W片段的核苷酸序列为EBV基因组13232‑16189所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针，其特征在于，所述探针为EB病毒BamHI-W片段经过标记得到；所述BamHI-W片段的核苷酸序列为EBV基因组13232-16189所示。2.根据权利要求1所述的FISH检测探针，其特征在于，所述标记采用Biotin-dUTP标记。3.一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针的制备方法，其特征在于，包括：培养EB病毒并提取EB病毒DNA作为模板，PCR扩增EB病毒BamHI-W片段，对所述BamHI-W片段进行标记得到标记产物；纯化所述标记产物后得到EB病毒FISH检测探针。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，培养EB病毒所用的宿主细胞为P3hr-1细胞。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，扩增EB病毒BamHI-W片段所用的上游引物核苷酸序列为：5’-CTTCTCTCTGTCCCCCTGCTCCTCT-3’；下游引物核苷酸序列为：5’-CTAGGGTCCCTTCTGGGGGACATCCT-3’。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述扩增的反应程序中，Tm值为53～57℃，反应循环次数为30～34次。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鹏飞，向娟娟，贺玉香，李桂源，赵谢兰，徐雅靖，付斌，卢景琛，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43