利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒。尤其是涉及包含由在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列构成的通用TaqMan探针，和由通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成的引物的试剂盒，以及利用所述试剂盒检测SNP的方法。

【技术实现步骤摘要】
利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒
本专利技术涉及利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒。尤其是涉及包含由在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列构成的通用TaqMan探针，和由通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成的引物的试剂盒，以及利用所述试剂盒检测SNP的方法。
技术介绍
目前常用于检测PCR产物，尤其是单核苷酸多态性(SNP)的方法主要涉及：(1)探针法(U.S.专利号：5,538,848)(CAST-PCR“Competitiveallele-specificTaqManPCR”)，该方法通过在扩增反应中杂交和切割双标记的发荧光的探针来检测特异性PCR产物。需要设计一个或者两个引物，这样的引物在序列改变的位点退火能够区分相同基因的不同等位基因。发荧光的探针由用荧光报告染料和淬灭染料标记的寡核苷酸构成。PCR过程中，该TaqMan探针如果杂交到含有SNP的片段，该探针被DNA聚合酶的5’-外切酶活性切割，产生报告染料荧光强度的增加。TaqMan探针的供体和淬灭基团优选位于探针3’-和5’-末端，因为荧光团和淬灭基团之间的5’-3’水解只有在荧光团和淬灭基团不是彼此接近时才发生；(2)分子信标法(molecularbeacon)，该方法也是利用荧光相互作用检测和定量PCR产物，每个探针都具有5’荧光标记的末端和3’淬灭剂标记的末端(美国专利5,925,517和Tyagi和Kramer等人，NatureBiotech，14:303-309(1996))。而且，分子信标探针还包括大约5-7个碱基的短末端区段，彼此互补并且在溶液中结合在一起形成茎环结构，淬灭剂和荧光标记的末端接近，信号得以抑制；(3)探针法，该方法也提供了茎环检测系统，与分子信标类似，除了探针也具有作为扩增引物的连接的区段(Whitcombe等，(1999)Nat.Biotechnol.17:804-807；U.S.Pat.No.6,326,145)。这些探针在未杂交状态保持茎环构象，荧光淬灭。在退火后再次发生变性，探针区段与模板结合，从而打开茎环结构并且释放荧光；(4)探针法，与探针类似，探针包括与发夹探针连接的引物在扩增期间延伸，从而将内部淬灭标记物与5’-末端荧光团分离开(Nazarenko等，NucleicAcidsResearch，25:2516-2521)；(5)ARMS(扩增阻碍突变系统)，该系统包括PCR引物和诊断引物，其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物(见引物设计)，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来(US专利No.5595890(1997))；(6)KASP法(等位基因特异性PCR)，该方法由英国LGC公司开发，涉及两个通用荧光探针，两个通用淬灭探针，通用荧光探针与通用淬灭探针形成双链的结构；通用反向引物；以及连接尾部序列的等位基因特异性正向引物；所述等位基因特异性引物所连接的尾部序列与通用荧光探针的序列互补；以及(7)Exiqon和Roche开发了UNIVERSALPROBELIBRARYTM(UPL)用于基因表达，该系统采用了一组165个短8-9碱基通用探针。这些短探针具有几个锁核酸(LNA)。与DNA杂交时具有很高的熔融温度，尽管很短。通用探针在5’末端也具有正常DNA碱基，因此能在PCR中被聚合酶的5’核酸酶活性切割。通用探针将可能的PCR引物位置限定在基因中。这165个通用探针组在大多数mRNA中具有足够的出现率，因此能够选择PCR引物，使得这165个通用序列中的至少一个能够位于两个引物之间。但是，检测分析并不是通用的，因为每个基因表达分析都需要两个靶-特异性引物。上述(1)-(5)和(7)的方法都涉及设计等位基因特异性引物，而且涉及的探针也是等位基因特异性探针，尤其是探针，虽然应用广泛，但是这些引物和探针的设计成本非常昂贵。法和分子信标法都是用作内部探针，与一对侧接目标靶区域的相反引物一起使用。而且这些检测方法和系统都具有序列的特异性和检测灵敏度低，以及信号出现的速度慢的缺陷。KASP法虽然是目前广泛采用的利用通用探针的方法，但是通用荧光探针与通用淬灭探针形成双链，并且只能用于SNP的分型检测。因此，亟待开发合成成本便宜、特异性和灵敏度高的利用通用(universal)引物和/或通用(universal)探针检测SNP，插入，缺失或突变的方法和试剂盒。
技术实现思路
第一方面，本专利技术涉及用于检测SNP，插入，缺失或突变的PCR引物组，所述引物组由以下引物构成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；和(3)一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成，或者由6-10个寡核苷酸构成，或者由11-15个寡核苷酸构成，或者由16-20个寡核苷酸构成，或者由21-25个寡核苷酸构成，或者由26-60个寡核苷酸构成，优选由15-25个寡核苷酸构成。优选地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组：(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQIDNO:1)；CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQIDNO:2)；(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQIDNO:3)；CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQIDNO:4)；(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO:5)；GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO:6)；和(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQIDNO:7)；GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQIDNO:8)。所述严格条件可以包括：例如在PCR的工作条件下，温度为大约50到70℃，更优选为大约60到65℃，在最优选情况下，温度为大约65℃。第二方面，本专利技术涉及用于检测SNP，插入，缺失或突变的通用TaqMan探针组，所述通用TaqMan探针组的组成如下：(1)第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测SNP或者插入或者缺失的PCR引物组，其特征在于所述引物组由以下引物构成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；和(3)一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。

【技术特征摘要】
1.用于检测SNP或者插入或者缺失的PCR引物组，其特征在于所述引物组由以下引物构成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；和(3)一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。2.根据权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成，或者由5-10个寡核苷酸构成，或者由11-15个寡核苷酸构成，或者由16-20个寡核苷酸构成，或者由21-25个寡核苷酸构成，或者由26-60个寡核苷酸构成，优选由15-25个寡核苷酸构成。3.根据权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组：(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQIDNO:1)；CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQIDNO:2)；(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQIDNO:3)；CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQIDNO:4)；(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO:5)；GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO:6)；和(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQIDNO:7)；GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQIDNO:8)。4.根据权利要求1-3任一项所述的PCR引物，其特征在于所述严格条件为：在PCR工作条件下，温度为50到70℃，更优选为60到65℃，在最优选情况下，温度为65℃。5.用于检测SNP或者插入或者缺失的通用TaqMan探针组，其特征在于所述通用TaqMan探针组的组成如下：(1)第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交；以及(2)第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。6.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述严格条件为：在PCR工作条件下温度为50到70℃，更优选为60到65℃，在最优选情况下，温度为65℃。7.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成，或者由5-10个寡核苷酸构成，或者由11-15个寡核苷酸构成，或者由16-20个寡核苷酸构成，或者由21-25个寡核苷酸构成，或者由26-60个寡核苷酸构成，优选由15-25个寡核苷酸构成。8.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组：(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQIDNO:1)；CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQIDNO:2)；(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQIDNO:3)；CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQIDNO:4)；(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO:5)；GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO:6)；和(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQIDNO:7)；GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQIDNO:8)。9.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述通用TaqMan探针组选自如下探针组：(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。10.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述报告荧光团选自5-羧基荧光素(5-FAM)，6-羧基荧光素(6-FAM)，2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET)，2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，NED，VIC，Alexa染料，Atto染料，Dyomic染料和Thilyte染料。11.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述第一通用TaqMan探针和第二通用TaqMan探针的两个报告荧光基团分别为FAM荧光基团和VIC荧光基团。12.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述淬灭基团选自TAMRA，BHQ，IOWABlack，QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。13.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述淬灭基团连接有小沟结合物MGB基团，所述小沟结合物MGB基团选自：CC1065类似物，偏端霉素，纺锤菌素，贝尼尔，多卡米星，喷他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。14.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组，其特征在于所述小沟结合物MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度(Tm)提高大约3℃至10℃。15.用于检测基因组中的SNP或者插入或者缺失的试剂盒，所述试剂盒包含如下成分或者由如下成分组成：(I)PCR引物组，所述引物组由以下引物构成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成，所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交；和(3)一条共用特异性反向引物，所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物，但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物；和(II)通用TaqMan探针组，所述通用TaqMan探针组的组成如下：(1)第一通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交；以及(2)第二通用TaqMan探针，其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补，或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交；所述成分(I)和成分(II)分别在试剂盒中不同的盒中或者在同一盒中，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单，在PCR扩增反应中不易出...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟晨光，赵丽娜，卢洪，
申请(专利权)人：中玉金标记北京生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11