高通量检测玉米抗丝黑穗病基因分型的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及高通量检测玉米丝黑穗病抗性基因分型的方法及其试剂盒。具体来说，本发明专利技术涉及用于高通量检测玉米丝黑穗病抗性基因的SNP分子标记物，其鉴定方法，用于检测这些SNP分析标记物的方法，引物组以及试剂盒。

High-throughput Detection of Maize Head Smut Resistance Genotyping and Its Kit

The invention relates to a method and a kit for high-throughput detection of Maize Head Smut Resistance Gene typing. Specifically, the present invention relates to SNP molecular markers for high-throughput detection of Maize Head Smut Resistance genes, identification methods, methods for detecting these SNP analytical markers, primers and kits.

【技术实现步骤摘要】
高通量检测玉米抗丝黑穗病基因分型的方法及其试剂盒
本专利技术涉及玉米丝黑穗病抗性的分子鉴定，特别是涉及用于玉米丝黑穗病抗性分子鉴定的分子标记的高通量检测。
技术介绍
玉米丝黑穗病(MaizeHeadSmut)是玉米生产中的重要病害之一。玉米丝黑穗病是由丝轴黑粉菌(Sporisoriumreiliaum)引起的病害；直接危害玉米花器官，造成感病植株绝产。采用先进的分子育种手段，充分利用玉米资源库中的抗性资源，进行抗病育种和抗病性改良是控制玉米丝黑穗病最经济有效的途径。玉米抗丝黑穗病基因ZmWAK位于第2染色体，编码细胞壁相关激酶。目前玉米丝黑穗病的抗性鉴定一般是在自然发病和人工接种致病菌的方法下进行抗性鉴定。这种直接观察抗性表型的鉴定方法，工作量巨大，且抗性表型受环境影响较大。因此，亟待开发适合高通量检测与玉米丝黑穗病抗性相关的分子标记物，以及能够高通量检测与玉米丝黑穗病抗性相关的分子标记物的方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术根据玉米种质资源中丝黑穗病抗性基因(ZmWAK)位点的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)信息，筛选适合高通量检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于高通量检测玉米丝黑穗病抗性基因ZmWAK位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物选自：A000607、A000611、A000612、A000613、A001014、A001016、A001017、A001018、A001020、A001021、A001022、A001023、A001024、A001028和A001029，以玉米基因组B73RefGen_V4版本染色体2为准，所述A000607对应的位置为238,555,355，等位位点1为C，等位位点2为T；A000611对应的位置为238,825,995，等位位点1为C，等位位点2为T；A000612对应的位置为2...

【技术特征摘要】
1.用于高通量检测玉米丝黑穗病抗性基因ZmWAK位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物选自：A000607、A000611、A000612、A000613、A001014、A001016、A001017、A001018、A001020、A001021、A001022、A001023、A001024、A001028和A001029，以玉米基因组B73RefGen_V4版本染色体2为准，所述A000607对应的位置为238,555,355，等位位点1为C，等位位点2为T；A000611对应的位置为238,825,995，等位位点1为C，等位位点2为T；A000612对应的位置为238,826,109，等位位点1为A，等位位点2为G；A000613对应的位置为238,586,393，等位位点1为T，等位位点2为C；A001014对应的位置为238,586,412，等位位点1为T，等位位点2为C；A001016对应的位置为238,586,732，等位位点1为A，等位位点2为T；A001017对应的位置为238,586,884，等位位点1为A，等位位点2为T；A001018对应的位置为238,586,994，等位位点1为C，等位位点2为G；A001020对应的位置为238,587,227，等位位点1为G，等位位点2为A；A001021对应的位置为238,587,278，等位位点1为G，等位位点2为A；A001022对应的位置为238,587,502，等位位点1为T，等位位点2为G；A001023对应的位置为238,772,226，等位位点1为C，等位位点2为G；A001024对应的位置为238,772,355，等位位点1为C，等位位点2为G；A001028对应的位置为238,772,650，等位位点1为G，等位位点2为C；A001029对应的位置为238,772,660，等位位点1为G，等位位点2为C。2.用于高通量检测玉米丝黑穗病抗性基因ZmWAK的方法，其特征在于所述方法包括从待检测的玉米品种获得的核酸样品中鉴定至少一种权利要求1限定的SNP标记物，所述方法选自：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸和等位基因-特异性扩增。3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述等位基因-特异性引物延伸中采用的等位基因特异性引物为选自如下的引物组：(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TGGCCTTCACCGATGTTGGAC(SEQIDNO:1)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TGGCCTTCACCGATGTTGGAT(SEQIDNO:2)；通用引物：AGATGTTAAAGGGCAGTTCATGTG(SEQIDNO:3)；(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCATCGGTACTCCATTCAAGC(SEQIDNO:4)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCATCGGTACTCCATTCAAGT(SEQIDNO:5)；通用引物：ATTGTTTGCCAATTTCACGTG(SEQIDNO:6)；(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-AATCAGTATAATTAATTTCCTGCA(SEQIDNO:7)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AATCAGTATAATTAATTTCCTGCG(SEQIDNO:8)；通用引物：ACGTGAAATTGGCAAACAATG(SEQIDNO:9)；(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGCTGTGCAATTACGCTGGT(SEQIDNO:10)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGCTGTGCAATTACGCTGGC(SEQIDNO:11)；通用引物：GCTGGATCACCCTGACATCG(SEQIDNO:12)；(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGCTGTGCAATTACGCTGGT(SEQIDNO:13)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGCTGTGCAATTACGCTGGC(SEQIDNO:14)，通用引物：TGCTGGATCACCCTGACATC(SEQIDNO:15)；(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TGGAGTGTTCCTCGTGCAGCA(SEQIDNO:16)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TGGAGTGTTCCTCGTGCAGCT(SEQIDNO:17)，通用引物：AGGATTCTAACGCTGATGCTGAG(SEQIDNO:18)；(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGCTTGTCCACAAGTTGTTCA(SEQIDNO:19)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GATGCTTGTCCACAAGTTGTTCT(SEQIDNO:20)；通用引物：CTCTTCGTCTCTTGCTTAAAAGCC(SEQIDNO:21)。(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACGCTGCTGTCAAGTACGGAC(SEQIDNO:22)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ACGCTGCTGTCAAGTACGGAG(SEQIDNO:23)；通用引物：GGCTTTTAAGCAAGAGACGAAGAG(SEQIDNO:24)；(9)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGTGCCTGTCTCGCTTCAG(SEQIDNO:25)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGTGCCTGTCTCGCTTCAA(SEQIDNO:26)；通用引物：GCTCGTCGCTGTGAAGAGCG(SEQIDNO:27)；(10)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGCTCGAGCAGGTCAAGG(SEQIDNO:28)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGCTCGAGCAGGTCAAGA(SEQIDNO:29)；通用引物：GCTCGTCGCTGTGAAGAGCG(SEQIDNO:27)；(11)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGCTGGTGCAAGACAAGCCT(SEQIDNO:30)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGCTGGTGCAAGACAAGCCG(SEQIDNO:31)；通用引物：GGCAGGTGTTCCCTGCTTCAG(SEQIDNO:32)；(12)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGGGAATTCATAGATGCATTGC(SEQIDNO:33)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GATGGGAATTCATAGATGCATTGG(SEQIDNO:34)，通用引物：TGGTATGGCTCCTCCTAGCTGA(SEQIDNO:35)；(13)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TGTCCAGTGAAACTGTTAGCTGTC(SEQIDNO:36)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TGTCCAGTGAAACTGTTAGCTGTG(SEQIDNO:37)，通用引物：GGTCCAATCCCAGCATCGC(SEQIDNO:38)；(14)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TGAGCTGATTATCCTGGAGCAG(SEQIDNO:39)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TGAGCTGATTATCCTGGAGCAC(SEQIDNO:40)；通用引物：CTTCACTGGAGCCATCCCG(SEQIDNO:41)；和(15)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCTGGGCAACATCTCCAAACTAG(SEQIDNO:42)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCTGGGCAACATCTCCAAACTAC(SEQIDNO:43)；通用引物：GGTCCCTATGAGCTGATTATCCTG(SEQIDNO:44)。4.权利要求1限定的一种或者多种SNP分子标记物在鉴定玉米丝黑穗病抗性中的应用。5.用于筛选玉米抗丝黑穗病基因ZmWAK位点与玉米抗丝黑穗病性状相关的SNP分子标记物的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)选择玉米ZmWAK基因区段附近的SNP；(2)根据所选择的SNP，设计对应于每个SNP的引物组；(3)以玉米基因组DNA作为模板，利用步骤(2)设计的引物组进行PCR扩增；(4)对经PCR扩增后的SNP位点进行基因分型，寻找基因分型成功的SNP标记物；以及(5)将基因分型成功的SNP标记物与有统计学意义已知抗丝黑穗病表型的样品进行对比，进行T-TEST计算，选择差异达到极显著水平的P<0.05的SNP分子标记物作为与玉米抗丝黑穗病表型相关的SNP分子标记物。6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述与玉米抗丝黑穗病性状相关的SNP为权利要求1限定的SNP。7.用于鉴定权利要求1限定的SNP标记物的引物组。8.根据权利要求7的引物组，其特征在于所述引物组选自：(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TGGCCTTCACCGATGTTGGAC(SEQIDNO:1)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TGGCCTTCACCGATGTTGGAT(SEQIDNO:2)；通用引物：AGATGTTAAAGGGCAGTTCATGTG(SEQIDNO:3)；(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCATCGGTACTCCATTCAAGC(SEQIDNO:4)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCATCGGTACTCCATTCAAGT(SEQIDNO:5)；通用引物：ATTGTTTGCCAATTTCACGTG(SEQIDNO:6)；(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-AATCAGTATAATTAATTTCCTGCA(SEQIDNO:7)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AATCAGTATAATTAATTTCCTGCG(SEQIDNO:8)；通用引物：ACGTGAAATTGGCAAACAATG(SEQIDNO:9)；(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGCTGTGCAATTACGCTGGT(SEQIDNO:10)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGCTGTGCAATTACGCTGGC(SEQIDNO:11)；通用引物：GCTGGATCACCCTGACATCG(SEQIDNO:12)；(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGCTGTGCAATTACGCTGGT(SEQIDNO:13)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGCTGTGCAATTACGCTGGC(SEQIDNO:14)，通用引物：TGCTGGATCACCCTGACATC(SEQIDNO:15)；(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TGGAGTGTTCCTCGTGCAGCA(SEQIDNO:16)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TGGAGTGTTCCTCGTGCAGCT(SEQIDNO:17)，通用引物：AGGATTCTAACGCTGATGCTGAG(SEQIDNO:18)；(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGCTTGTCCACAAGTTGTTCA(SEQIDNO:19)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GATGCTTGTCCACAAGTTGTTCT(SEQIDNO:20)；通用引物：CTCTTCGTCTCTTGCTTAAAAGCC(SEQIDNO:21)。(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACGCTGCTGTCAAGTACGGAC(SEQIDNO:22)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ACGCTGCTGTCAAGTACGGAG(SEQIDNO:23)；通用引物：GGCTTTTAAGCAAGAGACGAAGAG(SEQIDNO:24)；(9)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGTGCCTGTCTCGCTTCAG(SEQIDNO:25)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGTGCCTGTCTCGCTTCAA(SEQIDNO:26)；通用引物：GCTCGTCGCTGTGAAGAGCG(SEQIDNO:27)；(10)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGCTCGAGCAGGTCAAGG(SEQIDNO:28)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGCTCGAGCAGGTCAAGA(SEQIDNO:29)；通用引物：GCTCGTCGCTGTGAAGAGCG(SEQIDNO:27)；(11)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGCTGGTGCAAGACAAGCCT(SEQIDNO:30)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGCTGGTGCAAGACAAGCCG(SEQIDNO:31)；通用引物：GGCAGGTGTTCCCTGCTTCAG(SEQIDNO:32)；(12)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGGGAATTCATAGATGCATTGC(SEQIDNO:33)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GATGGGAATTCATAGATGCATTGG(SEQIDNO:34)，通用引物：TGGTATGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟晨光，刘利勤，柴宇超，高玉峰，卢洪，
申请(专利权)人：中玉金标记北京生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11