高通量检测小麦抗赤霉病基因分型的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及高通量检测小麦赤霉病抗性基因分型的方法及其试剂盒。具体来说，本发明专利技术涉及用于高通量检测小麦赤霉病抗性基因的SNP分子标记物，其鉴定方法，用于检测这些SNP分析标记物的方法，引物组以及试剂盒。

High throughput detection method for wheat scab resistance genotyping and kit

The invention relates to a high-throughput method for detecting wheat scab resistance gene typing and a kit. In particular, the present invention relates to a SNP molecular marker for high throughput detection of wheat scab resistance genes, an identification method, a method for detecting these SNP analysis markers, a primer group and a kit.

【技术实现步骤摘要】
高通量检测小麦抗赤霉病基因分型的方法及其试剂盒
本专利技术涉及小麦赤霉病抗性的分子鉴定，特别是涉及用于小麦赤霉病抗性分子鉴定的分子标记的高通量检测。
技术介绍
小麦赤霉病(Fusariumheadblight，FHB)别名麦穗枯、烂麦头、红麦头，是小麦的主要病害之一。小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)等多种镰刀菌引起；主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，从幼苗到抽穗都可受害，对小麦品质及生产造成很大的损失。采用先进的分子育种手段，充分利用小麦资源库中的抗性资源，进行抗病育种和抗病性改良是控制小麦赤霉病最经济有效的途径。因此，亟待开发适合高通量检测与小麦赤霉病抗性相关的分子标记物，以及能够高通量检测与小麦赤霉病抗性相关的分子标记物的方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术根据中国抗赤霉病品种的以下两个数量性状位点(QTL)：(1)小麦品种苏麦3号3B染色体上的FHB1；和(2)小麦品种望水白5A染色体上的FHB5，开发适合高通量检测与小麦赤霉病抗性相关的分子标记物，以及能够高通量检测与小麦赤霉病抗性相关的分子标记物的方法以及用于检测与小麦赤霉病抗性相关的分子标记物的试剂盒。具体而言，本专利技术根据中国小麦种质资源中涉及小麦赤霉病抗病相关位点的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)信息，筛选适合高通量检测抗小麦赤霉病的SNP作为分子标记物，并且设计出了用于检测所筛选SNP分子标记物的引物，以及相应的检测分型方法和相应的试剂盒，可以用于抗小麦赤霉病抗性的分子诊断，并且所获得的分子标记物可以辅助遗传改良。一方面，本专利技术提供了适合高通量检测小麦赤霉病抗性基因(FHB1和FHB5)位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物选自如下SNP标记物：A007308、A007320、A007324、A007521、A007526和A007541。以小麦基因组中国春Refseqv1.0版本染色体3B为准，所述A007308对应的位置为8,581,112，等位位点1为G，等位位点2为A；A007320对应的位置为8,528,802，等位位点1为T，等位位点2为A；A007324对应的位置为8,528,508，等位位点1为T，等位位点2为G；以小麦基因组中国春Refseqv1.0版本染色体5A为准，所述A007521对应的位置为107,453,934，等位位点1为C，等位位点2为T；A007526对应的位置为107,747,814，等位位点1为A，等位位点2为C；A007541对应的位置为108,284,392，等位位点1为A，等位位点2为G。小麦为自交系，SNP位点等位基因型分型有两种或三种：等位基因1纯合型，等位基因2纯合型，或者等位基因1和2杂合型。另一方面，本专利技术提供了用于高通量检测小麦赤霉病抗性的方法，所述方法包括从待检测的小麦品种获得的核酸样品中鉴定至少一种选自如下的SNP标记物：A007308、A007320、A007324、A007521、A007526和A007541。本领域技术人员可以根据已知序列的具体SNP位点选择鉴定方法，所述方法例如可以是：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增。具体的鉴定试剂可以选自例如等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。优选地，本专利技术中的鉴定试剂包括等位基因特异性引物。所述特异性引物可以是选自如下的引物组：(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TATGTTTGCAATCGTTTGTTTGTACATGG(SEQIDNO:1)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TATGTTTGCAATCGTTTGTTTGTACATGA(SEQIDNO:2)；通用引物：GACATATCAGAACTGGATAGCACGCAA(SEQIDNO:3)；(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CTCGAGAAGAAGGAAGCCCCT(SEQIDNO:4)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCTTGAGAAGAAGGAAGCTCCA(SEQIDNO:5)；通用引物：CTTCCAGTTTCTGCTGCCATTTCA(SEQIDNO:6)；(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAATATGATAGCGAATCTGAAGAGGAT(SEQIDNO:7)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AATATGATGGCGAATCTGAAGAAGAG(SEQIDNO:8)；通用引物：CTCCTGTGCGAGTGCTTCTTCCTT(SEQIDNO:9)；(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGAGAGAGAGAGAGAATTGAGC(SEQIDNO:10)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGAGAGAGAGAGAGAGAATTGAGT(SEQIDNO:11)；通用引物：CACCACCACCGAAAAGGTTGTTGTA(SEQIDNO:12)；(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCCTCTCCTCCTTGTTGGGT(SEQIDNO:13)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCTCTCCTCCTTGTTGGGG(SEQIDNO:14)，通用引物：GGCCTCGATGGGCAATGATATGTTA(SEQIDNO:15)；(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ATATTTCCTTCAAGGTTTACTAGTGACA(SEQIDNO:16)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTTCCTTCAAGGTTTACTAGTGACG(SEQIDNO:17)；通用引物：ATTGTTCACCACACTACACTTGTATGGTT(SEQIDNO:18)。另外，在已知小麦抗赤霉病基因(FHB1基因和FHB5基因)位点的特定SNP标记物的前提下，采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本专利技术的检测方法不限于采用哪些特异性引物组。本领域技术人员根据如下SNP标记物的位点附近的序列：A007308、A007320、A007324、A007521、A007526和A007541可以设计出不同的引物对，但都是基于本专利技术提供了上述SNP标记物这个前提，因此都在本专利技术的保护范围内。另一方面，本专利技术提供了如下SNP标记物：A007308、A007320、A007324、A007521、A007526和A007541中的一种或者多种在鉴定小麦赤霉病抗性中的应用。另一方面，本专利技术提供了筛选小麦抗赤霉病基因(FHB1基因和FHB5基因)位点与小麦抗赤霉病相关的SNP分子标记物的方法，所述方法包括如下步骤：(1)选择小麦抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于高通量检测小麦赤霉病抗性基因FHB1和FHB5位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物选自：A007308、A007320、A007324、A007521、A007526和A007541，以小麦基因组中国春Refseqv1.0版本染色体3B为准，所述A007308对应的位置为8,581,112，等位位点1为G，等位位点2为A；A007320对应的位置为8,528,802，等位位点1为T，等位位点2为A；A007324对应的位置为8,528,508，等位位点1为T，等位位点2为G；以小麦基因组中国春Refseqv1.0版本染色体5A为准，所述A007521对应的位置为107,453,934，等位位点1为C，等位位点2为T；A007526对应的位置为107,747,814，等位位点1为A，等位位点2为C；A007541对应的位置为108,284,392，等位位点1为A，等位位点2为G。

【技术特征摘要】
1.用于高通量检测小麦赤霉病抗性基因FHB1和FHB5位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物选自：A007308、A007320、A007324、A007521、A007526和A007541，以小麦基因组中国春Refseqv1.0版本染色体3B为准，所述A007308对应的位置为8,581,112，等位位点1为G，等位位点2为A；A007320对应的位置为8,528,802，等位位点1为T，等位位点2为A；A007324对应的位置为8,528,508，等位位点1为T，等位位点2为G；以小麦基因组中国春Refseqv1.0版本染色体5A为准，所述A007521对应的位置为107,453,934，等位位点1为C，等位位点2为T；A007526对应的位置为107,747,814，等位位点1为A，等位位点2为C；A007541对应的位置为108,284,392，等位位点1为A，等位位点2为G。2.用于高通量检测小麦赤霉病抗性基因FHB1和FHB5的方法，其特征在于所述方法包括从待检测的小麦品种获得的核酸样品中鉴定至少一种权利要求1限定的SNP标记物，所述方法选自：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增。3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述等位基因-特异性引物延伸中采用的等位基因特异性引物为选自如下的引物组：(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TATGTTTGCAATCGTTTGTTTGTACATGG(SEQIDNO:1)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TATGTTTGCAATCGTTTGTTTGTACATGA(SEQIDNO:2)；通用引物：GACATATCAGAACTGGATAGCACGCAA(SEQIDNO:3)；(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CTCGAGAAGAAGGAAGCCCCT(SEQIDNO:4)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCTTGAGAAGAAGGAAGCTCCA(SEQIDNO:5)；通用引物：CTTCCAGTTTCTGCTGCCATTTCA(SEQIDNO:6)；(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAATATGATAGCGAATCTGAAGAGGAT(SEQIDNO:7)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AATATGATGGCGAATCTGAAGAAGAG(SEQIDNO:8)；通用引物：CTCCTGTGCGAGTGCTTCTTCCTT(SEQIDNO:9)；(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGAGAGAGAGAGAGAATTGAGC(SEQIDNO:10)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGAGAGAGAGAGAGAGAATTGAGT(SEQIDNO:11)；通用引物：CACCACCACCGAAAAGGTTGTTGTA(SEQIDNO:12)；(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCCTCTCCTCCTTGTTGGGT(SEQIDNO:13)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCTCTCCTCCTTGTTGGGG(SEQIDNO:14)，通用引物：GGCCTCGATGGGCAATGATATGTTA(SEQIDNO:15)；(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ATATTTCCTTCAAGGTTTACTAGTGACA(SEQIDNO:16)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTTCCTTCAAGGTTTACTAGTGACG(SEQIDNO:17)；通用引物：ATTGTTCACCACACTACACTTGTATGGTT(SEQIDNO:18)。4.权利要求1限定的一种或者多种SNP分子标记物在鉴定小麦赤霉病抗性中的应用。5.用于筛选小麦抗赤霉病基因FHB1和FHB5位点与小麦抗赤霉病性状相关的SNP分子标记物的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)选择小麦FHB1和FHB5基因区段附近的SNP；(2)根据所选择的SNP，设计对应于每个SNP的引物组；(3)以小麦基因组DNA作为模板，利用步骤(2)设计的引物组进行PCR扩增；(4)对经PCR扩增后的SNP位点进行基因分型，寻找基因分型成功的SNP标记物；以及(5)将基因分型成功的SNP标记物与有统计学意义已知抗赤霉病表型的样品进行对比，进行T-TEST计算，选择差异达到极显著水平的P<0.05的SNP分子标记物作为与小麦抗赤霉病表型相关的SNP分子标记物。6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述与小麦抗赤霉病性状相关的SNP为权利要求1限定的SNP。7.用于鉴定权利要求1限定的SNP标记物的引物组。8.根据权利要求7的引物组，其特征在于所述引物组选自：(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TATGTTTGCAATCGTTTGTTTGTACATGG(SEQIDNO:1)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TATGTTTGCAATCGTTTGTTTGTACATGA(SEQIDNO:2)；通用引物：GACATATCAGAACTGGATAGCACGCAA(SEQIDNO:3)；(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CTCGAGAAGAAGGAAGCCCCT(SEQIDNO:4)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCTTGAGAAGAAGGAAGCTCCA(SEQIDNO:5)；通用引物：CTTCCAGTTTCTGCTGCCATTTCA(SEQIDNO:6)；(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAATATGATAGCGAATCTGAAGAGGAT(SEQIDNO:7)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AATATGATGGCGAATCTGAAGAAGAG(SEQIDNO:8)；通用引物：CTCCTGTGCGAGTGCTTCTTCCTT(SEQIDNO:9)；(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGAGAGAGAGAGAGAATTGAGC(SEQIDNO:10)；特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGAGAGAGAGAGAGAGAATTGAGT(SEQIDNO:11)；通用引物：CACCACCACCGAAAAGGTTGTTGTA(SEQIDNO:12)；(5)特...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟晨光，娄璐岩，李梦，安霞，柴宇超，高玉峰，卢洪，
申请(专利权)人：中玉金标记北京生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11