检测人CYP3A5基因分型的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，所述反应液包括针对CYP3A5基因6986位点的引物、探针，所述探针的5’端、3’端均标记有荧光基团，且所述5’端和3’端的荧光基团不同；所述试剂盒还包括DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶。利用具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶、特异性的双标记荧光探针和特异性引物通过实时PCR反应进行SNP检测CYP3A5的6986位点的基因多态性，且检测结果具有分辨率高、迅速、准确的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，涉及PCR荧光探针技术，尤其涉及一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
细胞色素P450(CytochromeP450proteins,CYP)是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白组成的结构和功能相似，由超家族基因编码的同工酶。CYP是一类位于人细胞微粒体、线粒体和内质网膜上的单加氧酶，参与催化内源物质，如甾体、胆汁酸、脂肪酸、生物源性氨类等的代谢，也代谢外源物质包括大多数药物。细胞色素P450广泛分布于人体的各器官，主要分布在人的肝脏和肠道中。其催化机理是原药在肝脏内经氧化、还原、水解反应脱去或增加一些功能基团使其变为极性较高的代谢产物，随尿液直接排出或进一步与葡萄糖醛酸、氨基酸、硫酸乙酰基、肽或甲基等结合再随尿液排出。细胞色素P450超家族中，与药物代谢相关的代谢酶主要是CYP1、CYP2、CYP3家族。CYP3A5是CYP3A亚家族的重要成员，参与多种药物的代谢。具有遗传多态性，存在个体、种族差异性，导致不同个体、种族的药物代谢能力存在差异。其中CYP3A5*3(6986A>G)在intron3的突变引起可变剪切，产生了不稳定的蛋白质，从而使得突变型纯合子个体不表达CYP3A5，能引起酶活性降低甚至消失。CYP3A5的不同基因型直接影响药物疗效和毒副作用的强弱，因此根据CYP3A5的基因型来指导准确、安全用药具有重要的临床意义。目前用于检测基因多态性的方法主要有测序法、PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)、基因芯片法、荧光定量PCR法。测序法结果准确，但成本高、耗时长。PCR-RFLP通过酶切电泳的方法检测基因多态性，成本低、结果直观，但操作过程易受污染，导致错误结果。基因芯片法通过核酸杂交检测基因型，优点是通量高，缺点是成本较高，操作繁琐，结果难判读。荧光定量PCR法具有操作简单、耗时短、结果准确可靠的优点，目前荧光定量PCR正在临床检查中得到越来越广泛的应用。依据其原理不同可分为荧光PCR探针法和荧光PCR熔解曲线法。前者针对目标SNP位点设计两种探针，分别和野生型与突变型匹配，利用扩增的Ct值差异来判读基因型。后者针对目标SNP位点设计一种探针，基于探针与目标核酸之间杂交的准确性(即SNP位点上不同碱基造成熔解温度的差异)来判读基因型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒及其检测方法，旨在解决现有技术难以实现CYP3A5基因分型的的问题。本专利技术是这样实现的，一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，所述反应液包括针对CYP3A5基因6986位点的引物、探针，其中，所述CYP3A5基因6986位点的引物序列如下：上游引物6986FP：5’-ATTATGGAGAGTGGCATAGGAG-3’；下游引物6986RP：5’-GCAAGAGTCTCACACAGGAG-3’；所述探针的5’端、3’端均标记有荧光基团，且所述5’端和3’端的荧光基团不同；所述试剂盒还包括DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶。以及，一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：提取人全血基因组DNA和上述试剂盒；按人全血基因组DNA提取液加入所述试剂盒的反应体系中，其中，所述人全血基因组DNA提取液和所述反应体系的比例比为1：8；PCR扩增；结果判定。本专利技术提供的检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，采用具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶，并利用这种聚合酶在切除瓣状结构中的5’端单链时的切割位置位于瓣状结构的双链部分的第一个碱基和第二个碱基之间这一特性，同时结合修饰有双重荧光标记及淬灭基团的双标记荧光DNA探针和特异性引物，通过实时PCR反应在单管中进行SNP检测，确定CYP3A5基因，确定位点的基因多态性，实现用一个荧光探针检测目标核酸SNP位点上的两种分型，且检测结果具有分辨率高、迅速、准确的优点。本专利技术提供的检测人CYP3A5基因分型的检测方法，检测SNP的特异性来源于具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶切除瓣状结构时的切割位置的准确性，相比之前的荧光PCR熔解曲线法更为准确。因此该方法在进行基因分型上相比传统的荧光定量PCR显示出了优势。此外，本专利技术方法具有操作简单、迅速、结果准确可靠的优点。附图说明图1是本专利技术实施例8中CYP3A5的6986位点AA纯合野生样本检测结果图；图2是本专利技术实施例8中CYP3A5的6986位点GG纯合突变样本检测结果图；图3是本专利技术实施例8中CYP3A5的6986位点AG杂合样本检测结果图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例所述检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，采用的技术原理是基于荧光PCR探针法，利用具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶，根据待检测位点设计特异引物、特异性的双标记荧光探针。本专利技术实施例提供了一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，所述反应液包括针对CYP3A5基因6986位点的引物、探针，其中，所述CYP3A5基因6986位点的引物序列如下：上游引物6986FP：5’-ATTATGGAGAGTGGCATAGGAG-3’；下游引物6986RP：5’-GCAAGAGTCTCACACAGGAG-3’；所述探针的5’端、3’端均标记有荧光基团，且所述5’端和3’端的荧光基团不同；所述试剂盒还包括DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶。本专利技术实施例所述探针的5’端、3’端均标记有荧光基团，且5’端、3’端的荧光基团不同。如当双重荧光标记DNA探针的5’端及3’端分别修饰有一个发出绿色荧光(如荧光素FAM)及红色荧光(如VIC)的基团，而在SNP位点的下一个碱基(沿5’端到3’端的方向)上修饰有一个淬灭基团(如IDT公司的ZENTMInternalQuencher)，该淬灭基团能够同时淬灭绿色荧光基团及红色荧光基团的荧光，因此，在进行PCR反应之前，该DNA探针是不发出任何荧光的。双重荧光标记DNA探针上由SNP位点到其3’端之间的序列与目标核酸上相应序列互补，而由SNP位点到其5’端之间的序列与目标核酸上相应序列不互补，因此形成瓣状结构，即部分为双链、部分为单链的“Y”形结构。由于所述DNA聚合酶具有瓣状核酸内切酶活性，当正向引物被延伸至荧光探针处时，荧光探针上不与目标核酸互补的序列会被聚合酶切除，即具有瓣状核酸内切酶活性的所述DNA聚合酶能够将瓣状结构中的5’端单链部分切除，切割位置在瓣状结构的双链部分的第一个碱基和第二个碱基之间。当目标核酸上SNP位点的碱基与荧光探针上的对应碱基互补时，则在SNP位点和下一个碱基之间切除。因此，绿色荧光基团与淬灭基团分离，从而产生绿色荧光。随着聚合酶继续切割荧光探针上与目标核酸互补的序列，淬灭基团也与另一端的红色荧光基团分离，从而产生红色荧光。因此，在绿色荧光基团与红色荧光基团的发光效率大致上相同的情况下，若目标核酸上的SNP位点的碱基与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液，所述反应液包括针对CYP3A5基因6986位点的引物、探针，其中，所述CYP3A5基因6986位点的引物序列如下：上游引物6986FP：5’‑ATTATGGAGAGTGGCATAGGAG‑3’；下游引物6986RP：5’‑GCAAGAGTCTCACACAGGAG‑3’；所述探针的5’端、3’端均标记有荧光基团，且所述5’端和3’端的荧光基团不同；所述试剂盒还包括DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶。

【技术特征摘要】
1.一种检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液，所述反应液包括针对CYP3A5基因6986位点的引物、探针，其中，所述CYP3A5基因6986位点的引物序列如下：上游引物6986FP：5’-ATTATGGAGAGTGGCATAGGAG-3’；下游引物6986RP：5’-GCAAGAGTCTCACACAGGAG-3’；所述探针的5’端、3’端均标记有荧光基团，且所述5’端和3’端的荧光基团不同；所述试剂盒还包括DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶。2.如权利要求1所述的检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，其特征在于，所述CYP3A5基因6986位点的探针序列如下：探针6986A：5’-TCTTTCAATATCTCTTCCCTGTTTGGA-3’；所述探针的5’端、3’端分别采用FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX、CAL、Fluor荧光基团中的一种进行标记，所述探针6986A的第9位T位点标记荧光淬灭基团。3.如权利要求1所述的检测人CYP3A5基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括UNG酶，所述UNG酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭爱女，罗晓腾，郭永超，周代志，
申请(专利权)人：深圳联合医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44