本公开描述了一种非诊断目的定性检测多种病原体基因的方法，是通过多重PCR对多种病原体基因的靶标区域进行检测的方法，包括以下步骤：准备待测核酸样本；同时向待测核酸样本加入第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物和人工质粒集合并进行第一轮PCR扩增以得到第一轮PCR扩增产物；其中，人工质粒集合包括多种具有预定拷贝数的并能够与第一正向引物和第一反向引物结合的人工质粒；对目标文库进行测序以获取测序数据，基于目标文库的序列判断待测核酸样本中的各个靶标区域是否被检出，由此判断病原体是否被检出。根据本公开，能够提供一种非诊断目的定性检测多种病原体基因的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种非诊断目的定性检测多种病原体基因的方法。
技术介绍
1、聚合酶链反应（即pcr）是一种广泛运用于分子诊断的技术，用于放大扩增特定的dna片段，可看作是生物体外的特殊dna复制。pcr的最大特点是将样品中微量的dna大幅增加，达到可检测的水平。伴随着测序技术，尤其是下一代测序技术（即ngs技术）的发展，对pcr产物进行高灵敏度及高分辨率的检测成为了可能，因此多重pcr可同步扩增的片段数量上限演变为多重pcr自身体系的限制。不同于传统仅仅进行3-5重，至多15重的pcr反应体系，上千重甚至上万重的超多重pcr（high-multiplex pcr或ultrahigh-multiplex pcr）的实现辅以ngs测序，形成的靶向-ngs技术（即tngs技术）已逐渐在传染病筛查、遗传病诊断、肿瘤基因检测等领域发挥作用。
2、超多重pcr希望实现较好的扩增性能，需要综合考虑反应多方条件，具有极高的技术壁垒。主要难点在于，若想在一个体系中实现上百、上千甚至上万个片段的特异性扩增，并非简单将引物混合扩增即可，不同引物的特异性、不同扩增片段本身的特异性及扩增条件均为需要综合考虑的内容。在这些因素中，引物二聚体和非特异扩增的形成，严重影响了超多重pcr扩增的性能。引物二聚体是由于引物间相互杂交形成的，在多重pcr反应体系中极高浓度下许多引物对的存在提高了引物二聚体形成，形成的引物二聚体会消耗大量引物和其他试剂进行扩增，从而对靶标dna序列的扩增造成不良影响，抑制靶标dna序列的扩增。
>3、尤其在对多种病原体基因进行检测时，在多重pcr引物池中包含了成百上千种病原微生物特异扩增的引物，但在实际待测样本中，通常只存在少量种类的微生物甚至没有，在这种情况下，成百上千种引物只有某几对引物实际会发生扩增，剩余的大量引物会由于没有目标dna模板消耗，而形成大量的二聚体或者非特异扩增，进而导致扩增文库质量较差。此外，很多病原体是条件致病（即必须达到一定浓度才能致病），因此对病原体进行定量检测也具有重要临床意义。
技术实现思路
1、本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种降低引物二聚体的、能够对病原体进行定量的同时检测多种病原体基因的方法和试剂盒。
2、为此，本公开第一方面提供一种同时检测多种病原体基因的方法，是对各个病原体基因的靶标区域进行检测的方法，包括以下步骤：准备待测核酸样本；向所述待测核酸样本加入第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物和人工质粒集合并进行第一轮pcr扩增以得到第一轮pcr扩增产物；其中，所述第一正向引物包括第一测序引物和与所述靶标区域5’端相匹配的序列；所述第一反向引物包括第二测序引物和与所述靶标区域3’端相匹配的序列；所述第二反向引物包括所述第二测序引物、第一条形码和第一测序接头；所述人工质粒集合包括多种具有预定拷贝数的并能够与所述第一正向引物和所述第一反向引物结合的人工质粒，所述人工质粒基于所述靶标区域的序列设计并异于所述靶标区域的序列；向所述第一轮pcr扩增产物加入第二正向引物和第三反向引物并进行第二轮pcr扩增以得到目标文库；其中，所述第二正向引物包括第二测序接头和所述第一测序引物；所述第三反向引物包括所述第一测序接头；对所述目标文库进行测序以获取测序数据，所述测序数据包括所述目标文库的序列，所述目标文库的序列包括所述第一条形码的序列；以及基于所述第一条形码的序列识别所述待测核酸样本，基于所述目标文库的序列和所述预定拷贝数判断所述病原体是否被检出以及得到所述病原体在所述待测核酸样本中的含量。
3、在本公开所涉及的方法中，在第一轮pcr扩增中，人工质粒集合能够通过与第一正向引物和第一反向引物结合，对体系中的第一正向引物和第一反向引物进行消耗，由此，能够减少引物二聚体的形成；第一轮pcr扩增体系中的第二反向引物可以通过第一反向引物与人工质粒集合结合，由此，人工质粒集合也能够对第二反向引物进行消耗，减少引物二聚体的形成；此外，加入到待测核酸样本中的人工质粒集合的拷贝数是已知的，为预定拷贝数，由此，能够通过所加入的人工质粒的拷贝数和测序数据，得到靶标区域的含量，也即对靶标区域进行定量，进而对待测核酸样本中的病原体进行定量。
4、在本公开所涉及的方法中，可选地，基于所述目标文库的序列得到所述靶标区域的reads数（读段数）和所述人工质粒的reads数，并基于所述预定拷贝数、所述靶标区域的reads数和所述人工质粒的reads数得到所述靶标区域的拷贝数，由此得到所述病原体的拷贝数。由此，能够通过所加入的人工质粒的拷贝数和测序所得到的人工质粒的reads数及靶标区域的reads数，得到靶标区域的拷贝数，也即对靶标区域进行定量，进而对病原体进行定量。
5、在本公开所涉及的方法中，可选地，所述人工质粒基于所述靶标区域的序列，通过增加序列、减少部分序列或替换部分序列的方式设计得到。由此，能够涉及得到和靶标区域相应的人工质粒。
6、在本公开所涉及的方法中，可选地，从每个病原体选取得到多个靶标区域，所述多个靶标区域之间互不重叠或仅部分重叠，对每个病原体的所述多个靶标区域进行检测，并基于所述多个靶标区域的检测结果判断所述病原体是否被检出。由此，能够提高检测结果的准确性。
7、在本公开所涉及的方法中，可选地，所述人工质粒的两端分别与所述第一正向引物和所述第一反向引物结合；所述人工质粒包括多个差异序列，距离与所述第一正向引物结合的序列的15bp内具有所述差异序列，距离与所述第一反向引物结合的序列的15bp内具有所述差异序列。由此能够便于将人工质粒和靶标区域区分开来。
8、在本公开所涉及的方法中，可选地，所述差异序列的长度为5bp。由此能够便于将人工质粒和靶标区域区分开来。
9、在本公开所涉及的方法中，可选地，所述预定拷贝数为200~400拷贝。由此，能够加入合适含量的人工质粒，即不会过多地影响引物和靶标区域的结合，也能够达到消耗引物的效果。
10、在本公开所涉及的方法中，可选地，所述第一测序引物和所述第二测序引物为illumina测序平台的测序引物，所述第一测序接头为illumina测序平台的p7接头，所述第二测序接头为illumina测序平台的p5接头，所述第一条形码为6~12bp的随机序列。由此，能够便于使用illumina测序平台对目标文库进行测序。
11、在本公开所涉及的方法中，可选地，所述第一正向引物中的与所述靶标区域5’端相匹配的序列如seq id no.1~36所示，所述第一反向引物中的与所述靶标区域3’端相匹配的序列如seq id no.37~72所示，所述人工质粒集合的序列如seq id no.77~112所示。
12、本公开第二方面提供一种同时检测多种病原体基因的试剂盒，是对各个病原体基因的靶标区域进行检测的试剂盒，包括第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物、第二正向引物、第三反向引物和人工质粒集合；所述第一正本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非诊断目的定性检测多种病原体基因的方法，是通过多重PCR对多种病原体基因的靶标区域进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一测序引物和所述第二测序引物为illumina测序平台的测序引物，所述第一测序接头为illumina测序平台的P7接头，所述第二测序接头为illumina测序平台的P5接头，所述第一条形码为6~12bp的随机序列。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的定性检测多种病原体基因的方法，是通过多重pcr对多种病原体基因的靶标区域进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
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【专利技术属性】
技术研发人员：王艳平，郭永超，徐仲尧，蔡锦刚，
申请(专利权)人：深圳联合医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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