【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种与甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1紧密连锁的snp分子标记、kasp标记引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、甘蓝型油菜是世界上第三大植物油来源，其产量约占全球食用油产量的13％。据统计，油菜含油量提高1％，相当于菜籽增产2.3～2.5个百分点长江流域主产区油菜种植面积占我国油菜生产总面积的90％，长江流域主产区菜籽的含油量为41％～42％。
2、dna分子标记法是现在作物品种纯度检测最常用方法。dna分子标记是直接反应dna差异(多态性)的一种遗传标记，目前主要为ssr(simple sequence repeat,简单重复序列)和snp(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)等。目前ssr大面积使用有它的优势，包括具有实验室操作简单，成本低，重复性较好，结果真实可靠等。比较起ssr标记法，snp标记法技术更简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；是快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定功能基因的最常用方法。
3、甘蓝型油菜紫叶性状是由于花色苷在叶片中的积累所产生的形态学变异。紫叶除可作为一种重要的指示性状运用于杂交制种外，其所富含的花色苷具有光保护、耐干旱、耐寒、减少病虫害以及抗氧化、抗肿瘤、改善心血管等诸多的生物学保健功能。
4、因此，油菜叶色性状对于育种是非常重要的性状之一，开发基于kasp技术的叶色基因bna03.pl1的功
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种与甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1紧密连锁的snp分子标记、kasp标记引物、试剂盒及其应用，能够快速、高通量、低成本实现叶色基因bna03.pl1的基因突变型进行鉴定。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
3、一种与甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1紧密连锁的snp分子标记，以甘蓝型油菜的darmor-bzh基因组版本为参考，所述snp分子标记在甘蓝型油菜a03染色体上的第3879543位碱基存在多态性，其多态性为a或g。
4、一种所述的snp分子标记的应用，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的叶色表型；鉴定所述甘蓝型油菜a03染色体上的第3879543位碱基为纯合a或a/g时，甘蓝型油菜的叶色表型为绿色；鉴定所述甘蓝型油菜a03染色体上的第3879543位碱基为纯合g时，甘蓝型油菜的叶色表型为紫色。
5、上述的应用，优选的，所述鉴定甘蓝型油菜叶色表型采用的kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
6、特异性引物x：gagatcccgatcgttcaggtt(如seq id no:1所示)；
7、特异性引物y：gagatcccgatcgttcaggtc(如seq id no:2所示)；
8、通用引物c：gacattagccaaaggattccacttg(如seq id no:3所示)。
9、优选的，所述应用的方法包括以下步骤：
10、(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总dna；
11、(2)以步骤(1)提取的dna为模板，分别利用所述的kasp标记引物进行pcr扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物x的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因x；如果只检测到特异性引物y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因y；如果同时检测到特异性引物x和y荧光，则该样品的基因型为杂合；
12、(3)根据基因型分型结果进行数据分析，得出甘蓝型油菜待测样品的叶色基因bna03.pl1分型。
13、优选的，所述方法采用douglas array tape平台进行；pcr扩增体系包括：100μm通用引物c、100μm特异性引物x、100μm特异性引物y、2×kasp master mix、甘蓝型油菜待测样品的dna、超纯水。
14、优选的，用soellex进行pcr扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。
15、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种鉴定甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1的kasp标记引物，所述kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
16、特异性引物x：gagatcccgatcgttcaggtt(如seq id no:1所示)；
17、特异性引物y：gagatcccgatcgttcaggtc(如seq id no:2所示)；
18、通用引物c：gacattagccaaaggattccacttg(如seq id no:3所示)。
19、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种鉴定甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1的试剂盒，包含上述的kasp标记引物。
20、上述的试剂盒，优选的，所述特异性引物x、特异性引物y、通用引物c在pcr反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
21、优选的，所述试剂盒中还包含2×kasp master mix和超纯水。
22、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种所述kasp标记引物或所述试剂盒在鉴定甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1中的应用。
23、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
24、(1)本专利技术筛选出一个与甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1紧密连锁的snp标记的kasp标记引物组和试剂盒，用于叶色基因bna03.pl1突变型的精准鉴定，这个标记分型质量高、单拷贝、高多态性(在现有甘蓝型油菜资源中的pic值高于>0.3)，样本数据检出率>98％，可用于甘蓝型油菜的叶色育种改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。
25、(2)本专利技术还提供了上述kasp标记引物和试剂盒鉴定甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1的应用方法，该检测方法简单、自动化程度高达90％；检测通量高、速度快(8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板snp基因分型方法的10倍)；检测反试剂用量少(仅0.8ul/反应)，试剂耗材成本低(与传统的96孔板snp基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％)；检测结果准确、重复性和稳定性好，不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；本专利技术提供了一种快速、高效、低成本、精准检测的普适性方法。
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1.一种与甘蓝型油菜叶色基因BnA03.PL1紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，以甘蓝型油菜的Darmor-bzh基因组版本为参考，所述SNP分子标记在甘蓝型油菜A03染色体上的第3879543位碱基存在多态性，其多态性为A或G。
2.一种如权利要求1所述的SNP分子标记的应用，其特征在于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的叶色表型；鉴定所述甘蓝型油菜A03染色体上的第3879543位碱基为纯合A或A/G时，甘蓝型油菜的叶色表型为绿色；鉴定所述甘蓝型油菜A03染色体上的第3879543位碱基为纯合G时，甘蓝型油菜的叶色表型为紫色。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定甘蓝型油菜叶色表型采用的KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法采用Douglas Array Tape平台进行；PCR扩增体系包括：100μM通用引物C、100μM特异性引物X、100μM特异性引物Y、2×KASPMast
6.一种鉴定甘蓝型油菜叶色基因BnA03.PL1的KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
7.一种鉴定甘蓝型油菜叶色基因BnA03.PL1的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求6所述的KASP标记引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含2×KASP MasterMix和超纯水。
10.一种如权利要求6所述的KASP标记引物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒在鉴定甘蓝型油菜叶色基因BnA03.PL1中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种与甘蓝型油菜叶色基因bna03.pl1紧密连锁的snp分子标记，其特征在于，以甘蓝型油菜的darmor-bzh基因组版本为参考，所述snp分子标记在甘蓝型油菜a03染色体上的第3879543位碱基存在多态性，其多态性为a或g。
2.一种如权利要求1所述的snp分子标记的应用，其特征在于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的叶色表型；鉴定所述甘蓝型油菜a03染色体上的第3879543位碱基为纯合a或a/g时，甘蓝型油菜的叶色表型为绿色；鉴定所述甘蓝型油菜a03染色体上的第3879543位碱基为纯合g时，甘蓝型油菜的叶色表型为紫色。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定甘蓝型油菜叶色表型采用的kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法采用douglas array tape...
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