【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种三七pnmyb7基因以及其在提高植物抗菌能力中的应用。
技术介绍
1、三七（ panax notoginseng (burk.) f.h. chen）是我国传统中药材之一，属于五加科人参属，与人参属于同一科，有“参中之王”等美誉，主要化学成分包括皂苷、多糖、氨基酸、三七黄酮、生物碱等多种物质，具有止血、补血、降血糖血脂、调节免疫和抗炎等良好的药理作用。近年来，随着国内中药产业的迅速发展，三七的市场销售量也变得越来越大，因此能够促进云南省的经济增长。
2、myb转录因子参与了植物体内如环境应答、胁迫响应等众多的生理反应，在许多方面都具有不可替代的作用。myb转录因子作为与抗性相关的重要调节因子，随着全基因组测序以及实验技术的升级，使得myb转录因子受到人们的关注，成为提高植物抗性能力的研究热点。myb转录因子在n端含有高度保守的myb结构域。一个myb结构域由50至52个氨基酸组成，一般有3个保守的色氨酸残基，并编码三个α螺旋，形成螺旋-转角-螺旋结构。根据保守结构域的数量，分为1r-myb（myb-related）、r2r3-myb、4r-myb、3r-myb四种，其中 r2r3-myb转录因子在植物中发现的数量最多。r2r3-myb转录因子，在n端包含两个myb保守结构域，在植物参与生物胁迫、非生物胁迫、合成代谢等生理反应中具有重要作用。
3、生物胁迫是由微生物、病虫、动物等生物对植物造成危害的一类统称。许多基因及蛋白
4、非生物胁迫包括干旱、盐碱、高低温、糖胁迫等，同样会对植物生长发育等产生不良影响。为完成整个生长周期，植物体通过调控胁迫下的相关代谢水平，保证细胞的内稳态。研究发现，山定子mbmybc1基因在拟南芥中过表达，可以激活下游与干旱胁迫相关的atrd29a启动子、atsod1和atp5cs1的表达，表明mbmybc1对干旱胁迫具有正响应。在苦荞中，幼苗经过甘露醇和nacl处理后，ftmyb41基因的表达量被诱导上调，因此推测ftmyb41基因能积极响应干旱胁迫。
5、三七是我国传统的中药品种，常用来治疗心脑血管系统等方面的疾病，且效果显著。云南省是三七原料的主要种植地，是云南中药品种的支柱产业。由于三七性喜温暖阴湿及连年大面积单一种植，为病害的发生和传播创造了便利的条件。三七根腐病在三七整个生长发育过程中均可发病，在各种病害引起的经济损失中占比为75% ~ 80%，成为制约三七产业发展的主要因素。目前对三七根腐病的防治比较常用的方法仍然是使用化学杀菌剂，但并不能起到彻底防治作用，同时伴随农药残留和环境污染等问题。因此，寻求绿色安全的有效防控措施对三七产业发展至关重要。而挖掘三七中与植物抗病相关的基因，对揭示三七抗病机制，培育三七抗病品种具有重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种三七pnmyb7基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示，编码如seq id no:2所示氨基酸序列的蛋白质；其从三七（ panax notoginseng (burk.) f.h.chen）植株中克隆而得，基因序列全长894bp，编码的pnmyb7蛋白由297个氨基酸组成，分子量约为32kda。
2、本专利技术另一目的是将上述三七pnmyb7基因应用在提高植物对尖孢镰刀菌（ fusarium oxysporum）的抗性中。
3、为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：
4、1、从云南省昆明理工大学生命科学与技术学院大棚中种植的三七植株中提取总rna，根据基因序列设计引物，用三七的cdna为模板，用设计好的引物扩增myb7基因全长片段及各缺失片段，将扩增片段连接到pmd-19t载体上并转化大肠杆菌dh5α，然后涂布含氨苄青霉素的平板，挑取阳性菌落测序，鉴定出编码myb7蛋白的基因序列，其序列如seq id no:1所示，该蛋白由297个氨基酸编码，氨基酸序列如seq id no:2所示；
5、2、从测序正确的pmd-19t-myb7f、pmd-19t-myb7n、pmd-19t-myb7c上回收各个目的片段，连接到经限制性内切酶酶切的酵母表达载体pgbkt7质粒上，得到重组质粒pgbkt7-pnmyb7f、pgbkt7-pnmyb7n、pgbkt7-pnmyb7c，将各个重组质粒用liac法转化酿酒酵母菌y2hgold菌株，并涂布在sd/-trp培养基上进行培养，获得重组酵母菌株y2hgold-pgbkt7、y2hgold-pgbkt7-pnmyb7f、y2h gold-pgbkt7-pnmyb7n、y2hgold-pgbkt7-pnmyb7c。将上述酵母菌株在sd/-trp-his-ade培养基上培养，明确了pnmyb 转录因子具有转录激活作用，确定了转录激活结构域位于c端。
6、3、用qrt-pcr 技术分析在水杨酸（salicylic acid，sa）处理、尖孢镰刀菌侵染、水杨酸和尖孢镰刀菌共处理下，三七pnmyb7基因在叶片中的转录水平。结果表明，水杨酸处理、尖孢镰刀菌侵染及二者共同处理均能诱导pnmyb7基因表达。
7、4、以三七cdna为模板，用特异引物扩增pnmyb7片段，然后用同源重组的方法与经限制性内切酶酶切的pri101-gfp载体连接并转化大肠杆菌dh5α获得重组质粒pri101-gfp-pnmyb7和含重组表达质粒的重组大肠杆菌菌株dh5α-pri101-gfp-pnmyb7。
8、5、将测序正确的pri101-gfp-pnmyb7重组质粒利用反复冻融法转入农杆菌lba4404菌株中，获得含重组表达质粒的重组农杆菌菌株lba4404-pri101-gfp-pnmyb7，首先利用瞬时表达初步探究pnmyb7在植物抗生物胁迫中的作用，然后利用叶盘法将重组农杆菌菌株lba4404-pri101-gfp-pnmyb7遗传转化至烟草叶片中，经过筛选培养，成功获得含三七pnmyb7基因的转基因烟草，并检测了pnmyb7转基因烟草与野生型烟草叶片中4个相关防卫基因pal4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三七PnMYB7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的三七PnMYB7基因在提高烟草对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）抗性中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种三七pnmyb7基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
2.权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：年洪娟，陈诗依，陈云洱，李昆志，徐慧妮，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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