定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物，正向扩增引物及反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记；本发明专利技术还涉及一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序试剂盒。所述试剂盒包括扩增引物、PCR反应液1、PCR反应液2、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明专利技术具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外核酸检测
，尤其涉及一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。
技术介绍
细胞色素P450 2D6(Cytochrome P450 2D6，CYP2D6)是CYP酶系中一种非常重要的药物代谢酶。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，在人类又可分成5个亚家族，编号为A～E。CYP2D位于第22号染色体上，由CYP2D6、CYP2D7P和CYP2D8P共同组成，其中CYP2D7P和CYP2D8P是假基因，不表达。CYP2D6作为一个完整的功能基因，包含9个外显子和8个内含子，总长7kb左右。CYP2D6是最早发现的具有基因多态性的P450酶，目前，已发现CYP2D6有70多种突变基因，其中，超过15个译成密码后是无活性或非酶，另外一些分别译成活性减少、“正常”或活性增强的酶。CYP2D6基因的主要突变方式是单个碱基的缺失或替换引起读码框架移位，或是大片段基因的丢失。CYP2D6酶主要分布于人体肝脏中，占肝脏酶总量的2％～9％，但却参与20％～30％临床常用药物的代谢，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、抗肿瘤药物等。CYP2D6的基因突变类型较多，其中CYP2D6*2、*3、*4、*5、*6、*10等位基因在高加索人中都有发现，CYP2D6*2和*17主要存在于非洲人中，而在亚洲人群中的突变类型主要是CYP2D6*10。与野生型CYP2D6相比，*10主要是外显子1C188→T转换，造成Pro(脯氨酸)34→Ser(丝氨酸)取代，导致编码的酶不稳定，降低CYP2D6的酶活性。按基因型可将CYP2D6*10分为：在外显子1第188位点上携带两个有活性等位基因的野生型纯合子C/C(CYP2D6*1/*1)，携带两个导致酶活性降低的等位基因的突变纯合子T/T(CYP2D6*10/*10)和只含一个正常等位基因的杂合子C/T(CYP2D6*1/*10)。另一个亚洲人常见单核苷酸多态是CYP2D6外显子9G4268→C颠换，造成了Ser(丝氨酸)486→Thr(苏氨酸)取代，导致表达的酶活性降低。他莫昔芬是乳腺癌内分泌治疗应用最为广泛的药物。4-羟-N-去甲基他莫昔芬是他莫昔芬代谢的主要活性物质，能抑制激素依赖的乳腺癌细胞的扩散，其生成主要依赖于CYP2D6的酶活性。多项研究表明其中CYP2D6*10/*10基因型导致酶活性下降或者抑制酶活性，从而影响他莫昔芬的代谢，进而导致他莫昔芬的治疗疗效的差异。研究显示，CYP2D6*10/*10基因型携带患者对他莫西芬的治疗不敏感。β受体阻断药是临床常用的一线抗高血压药物，其代表药物有美托洛尔(Metoprolol)、普萘洛尔(Propranolol)、卡维地洛(Carvedilol)。普罗帕酮(Propafenone)为广谱高效膜抑制性抗心律失常药，具有膜稳定作用及竞争性β受体阻滞作用。这些药物大约70-80％在人体内经CYP2D6代谢。研究发现，不同个体中药物的血药浓度最多可相差20倍，因此CYP2D6的基因多态性从这些药的药代动力学和药效动力学上影响其毒副反应的发生。研究表明，在相同剂量条件下，PM(中国人群主要为CYP2D6*10/*10)患者的美托洛尔口服清除率比EM(CYP2D6*1/*1)患者低40％，代谢减慢，CYP2D6所介导代谢的美托洛尔的血药浓度比EM患者高2～3倍，更易出现心率减慢、传导阻滞、血压降低、心力衰竭加重、外周血管痉挛导致的四肢冰冷或脉搏不能触及、雷诺现象。如不根据基因型调整剂量，突变纯合子患者可能发生严重的毒副反应。也有研究表明，CYP2D6基因型在普罗帕酮血浆浓度和效应中起着重要作用。450mg/d剂量组中具有CYP2D6*10突变纯合子的病人，普罗帕酮血浆峰浓度约为野生基因型的2倍，而且室性早搏(VPC)抑制率也增加一倍。美国食品药品监督管理局(FDA)建议：在使用心血管类药物如美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛和普罗帕酮之前需要对患者的CYP2D6基因进行检测。精神分裂症(Schizophrenia)是常见的精神疾病之一，发病率为1％左右。目前广泛应用的抗精神病药物包括传统抗精神分裂症药物如氟哌啶醇、奋乃静等以及非典型抗精神分裂症药物如氯氮平、利培酮、阿立哌唑等。临床治疗中，发现同样剂量下用药有相当一部分病人在服药后发生椎体外系副反应、粒细胞缺乏症或体重增加等副作用。研究表明，氟哌啶醇、阿立哌唑、利培酮、奋乃静、硫利达嗪、氯氮平、伊潘立酮、匹莫齐特等均由CYP2D6代谢，其副反应均与此酶活性有关，而CYP2D6酶活性受其编码基因的基因型影响。Kirchheiner等进行了荟萃分析，揭示了大约50％的常用抗精神病药物的剂量取决于CYP2D6基因型。在一项研究中对100名住院患者连续进行CYP2D6表型的测定并给药，在接受CYP2D6底物药物治疗的患者中具有PM表型的患者人群中不良反应的发生率最高。而且在一项有关美国精神病治疗的研究中显示，CYP2D6多态性对患者的治疗费用有很大的影响。因此，对于接受单一或多重由CYP2D6代谢的药物进行治疗的患者来说，基因型测定可以帮助临床医生在已知待选药物的代谢的基础上进行适当的选择，从而避免不良的药物—药物相互作用。通过恰当的剂量调节来防止不良反应的发生，更好地进行个体化药物治疗。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测CYP2D6基因分型的产品。目前，在现有技术中，尤其是在医院内，采用有“金标准”之称的PCR-直接测序法对CYP2D6基因进行检测，但该方法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20％以上的肿瘤组织及外周血，对于突变细胞比率小于10％的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接测序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作繁琐的缺点。
技术实现思路
为了解决上述方法检测CYP2D6基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操作繁琐及成本高的技术问题，本专利技术提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。本专利技术提供了一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述引物对包括：(1)对于CYP2D6C188T等位基因，扩增引物为：CYP2D6C188T正向扩增引物：5’-GCCGTGAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述引物对包括：(1)对于CYP2D6C188T等位基因，扩增引物为：CYP2D6C188T正向扩增引物：5’‑GCCGTGATAGTGGCCATCTT‑3’；CYP2D6C188T反向扩增引物：5’‑TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT‑3’；CYP2D6C188T测序引物：5’‑GGCAGGGGGCCTGGT‑3’；其中，所述CYP2D6C188T正向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于CYP2D6G4268C等位基因，扩增引物为：CYP2D6G4268C正向扩增引物：5’‑CATGGTGTCTTTGCTTTCCT‑3’；CYP2D6G4268C反向扩增引物：5’‑GGCACAGCACAAAGCTCAT‑3’；CYP2D6G4268C测序引物：5’‑CTCATAGGGGGATGG‑3’；其中，所述CYP2D6G4268C正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

【技术特征摘要】
1.一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述引物对包括：(1)对于CYP2D6C188T等位基因，扩增引物为：CYP2D6C188T正向扩增引物：5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’；CYP2D6C188T反向扩增引物：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’；CYP2D6C188T测序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’；其中，所述CYP2D6C188T正向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于CYP2D6G4268C等位基因，扩增引物为：CYP2D6G4268C正向扩增引物：5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’；CYP2D6G4268C反向扩增引物：5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’；CYP2D6G4268C测序引物：5’-CTCATAGGGGGATGG-3’；其中，所述CYP2D6G4268C正向扩增引物的5’端进行生物素标记。2.一种定性检测CYP2D6基因分型的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述CYP2D6基因检测的多态性位点为CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述试剂盒包括：(1)对于CYP2D6C188T等位基因，CYP2D6C188T正向扩增引物：5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’；PCR反应液1，所述PCR反应液1含有CYP2D6C188T反向扩增引物：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’；CYP2D6C188T测序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’；其中，所述CYP2D6C188T正向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于CYP2D6G4268C等位基因，CYP2D6G4268C正向扩增引物：5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’；PCR反应液2，所述PCR反应液2含有CYP2D6G4268C反向扩增引物：5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，辛盛，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43