一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，能够高效准确地鉴定药品生产环境中常见细菌污染物，包括步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；步骤四，提取并纯化PCR产物；步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；步骤六，应用序列分析软件进行序列拼接，以通用核酸测序引物对定位，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤七，将步骤六相应片段的DNA序列导入DNA条形码标准序列核心数据库或GenBank数据库中进行序列对比，对细菌进行鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法
本专利技术涉及一种核酸测序鉴定方法，尤其涉及一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法。
技术介绍
16S核糖体RNA(16SribosomalRNA,16SrRNA)是细菌系统分类学研究中最常用的分子标记，全长约1500bp左右，包含9个可变区(VariableRegion,V区)和10个恒定区(ConstantRegion,C区)，在结构与功能上具有高度保守性，适用于进化距离不同的各类细菌亲缘关系研究。随着药品生产质量规范(GMP2010)和国家药品质量标准的提升，药品生产和质量控制中对于微生物鉴定的要求越来越高，如美国注射剂协会技术指南(ParenteralDrugAssociationTechnicalReport，PDATR)中要求，ISO5或6级(A/B)区中所有超警戒限或纠偏限度的分类菌株，包括原料、辅料、制剂、环境和水等，对于分离到的微生物应鉴定到“种”的水平；《中国药典》2015年版四部微生物检查法及指导原则中要求，对于药品中的检出微生物，需采用适宜的方法技术手段进行鉴定。目前，以16SrRNA核酸测序技术为基础的微生物鉴定方法已经建立，并应用于临床分离菌株的研究(16SrRNAgenesequenceanalysisforbacterialidentificationintheclinicallaboratory.RinshoByori.2013Dec；61(12):1107-15；TheuseofmoleculartechniquesbasedonribosomalRNAandDNAforrumenmicrobialecosystemstudies:areview.MolBiolRep.2008Jun；35(2):265-74.)，但其用于药品质量控制及药品生产环境中常见污染菌的鉴定还鲜有报道；以16SrRNA核酸测序方法进行微生物鉴定的文献中，所选取的测序靶点和测序引物各异(Reviewandre-analysisofdomain-specific16Sprimers.JMicrobiolMethods.2003Dec；55(3):541-55；Identificationofbacteriathrough16SrRNAsequencing:principles,methodsandapplicationsinclinicalmicrobiology.EnfermInfeccMicrobiolClin.2004Apr；22(4):238-45.)，符合药品质量控制要求的具有鉴定和分类意义的DNA条形码核酸序列片段尚不清晰明确；现有研究中的核酸测序结果多数是通过Blast分析法与Genebank数据库中的核酸序列进行比对，对于测序结果的质量核查和Genebank数据库中序列信息的准确性关注度较小，测序结果的判定依据尚不规范统一。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，能够高效准确地鉴定药品生产环境中常见细菌污染物。本研究在广泛查阅《美国药典》、《欧洲药典》、《日本药典》等国内外药品质量标准、《伯杰氏系统细菌学手册》和国内外权威参考文献的基础上，确立了以细菌16SrRNA为基础的核酸测序鉴定技术方案。通过比较药品生产环境中葡萄球菌、微球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、革兰阴性肠杆菌等常见微生物污染物的16SrRNA序列，以可变区中特异性核酸序列为DNA条形码、以恒定区中保守核酸序列设计通用测序引物，确定符合药品微生物质量控制要求的标准核酸序列的范围和长度，并通过Genebank数据库Blast分析、国家权威微生物菌种保藏中心的代表性标准菌株和实验室分离株鉴定进行DNA条形码序列的验证，最终确立用于药品生产环境中常见微生物污染物鉴定的DNA条形码，并建立DNA条形码标准核酸序列数据库。为了实现上述技术目的，本专利技术所采取的技术措施为：一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，包括以下步骤：步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；步骤四，提取并纯化PCR产物；步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；步骤六，应用序列分析软件进行序列拼接，以通用核酸测序引物对定位，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤七，将步骤六相应片段的DNA序列导入DNA条形码标准序列核心数据库或GenBank数据库中进行序列对比，对细菌进行鉴定。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所提供的技术措施还包括：优选地，所述通用核酸测序引物对选自序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8中的一对。优选地，所述DNA条形码标准序列核心数据库建立方法为：步骤A，Genebank数据库检索目标菌属，获得其16SrRNA核酸序列；步骤B，将步骤A获得的核酸序列进行序列比对分析，选择具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，并根据保守区域核酸序列设计通用核酸测序引物对；步骤C，以核酸测序通用引物对为两端进行定位，截取长度相同的核酸序列片段，并获取可信度高的核酸序列片段，将该序列导入序列分析软件进行聚类分析，构建NJ化树；步骤D，对NJ进化树中各类菌属的聚类关系进行分析；通过NJ进化树的聚类关系分析进一步验证各菌株中具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，最终确定各类菌属核酸测序鉴定的DNA条形码序列，作为核心参比序列录入DNA条形码标准序列核心数据库。更优选地，DNA条形码标准序列核心数据库建立方法还包括：步骤E，收集整理国家权威微生物菌种保藏中心的代表性标准菌株和微生物检验实验室的常见环境细菌菌株，提取基因组DNA，以通用测序引物扩增DNA条形码区域的核酸序列，经序列拼接和测序质量的核查，确认DNA条形码标准核酸序列，经与核心参与序列比对无误后录入数据库。进一步地，所述步骤三中PCR扩增反应体系以25μl为参照，包括：1×PCR反应缓冲液，2.5mmol/LMgCl2，2.5mmol/LdNTPs，10umol/L正向/反向引物对，DNA模板，1.0UTaqDNA聚合酶，加无菌双蒸水至25μl；同时设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照；PCR扩增反应程序：94℃，预变性1min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸3min。进一步地，所述步骤四中提取并纯化PCR产物具体操作为采取1.5％琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，将3～5μlPCR产物与上样缓冲液混合均匀，加入含1.5％琼脂糖凝胶孔中，在TAE缓冲液中电泳，同时选用合适的DNA梯度标准品作为参考，电泳后，在紫外凝胶成像仪中确认单一目标条带的存在，然后去除多余的PCR引物和脱氧核糖核苷酸分子。进一步地，所述步骤五中测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列过程为：将已纯化的PCR产物加载入核酸测序仪，以通用核酸测序引物进行双向测序，获得PCR产物的核酸序列。进一步地，所述步骤七中对细菌进行鉴定中，菌株亲缘关系小于或等于97％认定为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；步骤四，提取并纯化PCR产物；步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；步骤六，应用序列分析软件进行序列拼接，以通用核酸测序引物对定位，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤七，将步骤六相应片段的DNA序列导入DNA条形码标准序列核心数据库或GenBank数据库中进行序列对比，对细菌进行鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，获取并培养获得单克隆菌株；步骤二，提取步骤一获得的单克隆菌株的基因组DNA；步骤三，使用通用核酸测序引物对PCR扩增菌株特定序列；步骤四，提取并纯化PCR产物；步骤五，测定步骤四得到的PCR产物的核酸序列；步骤六，应用序列分析软件进行序列拼接，以通用核酸测序引物对定位，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；步骤七，将步骤六相应片段的DNA序列导入DNA条形码标准序列核心数据库或GenBank数据库中进行序列对比，对细菌进行鉴定。2.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述通用核酸测序引物对选自序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8中的一对。3.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述通用核酸测序引物对为序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对。4.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述DNA条形码标准序列核心数据库建立方法为：步骤A，Genebank数据库检索目标菌属，获得其16SrRNA核酸序列；步骤B，将步骤A获得的核酸序列进行序列比对分析，选择具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，并根据保守区域核酸序列设计通用核酸测序引物对；步骤C，以核酸测序通用引物对为两端进行定位，截取长度相同的核酸序列片段，并获取可信度高的核酸序列片段，将该序列导入序列分析软件进行聚类分析，构建NJ化树；步骤D，对NJ进化树中各类菌属的聚类关系进行分析；通过NJ进化树的聚类关系分析进一步验证各菌株中具有鉴定和分类意义的核酸序列片段，最终确定各类菌属核酸测序鉴定的DNA条形码序列，作为核心参比序列录入DNA条形码标准序列核心数据库。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯震，杨美成，李芳，李琼琼，杨燕，洪小栩，许华玉，刘浩，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：上海,31