检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供一种检测脱氧核糖核酸酶活性的DNA探针、试剂盒和方法，采用发夹状DNA探针为脱氧核糖核酸酶的底物，探针的两端或内部分别标记上荧光基团及对应的荧光淬灭基团。当探针结构完整时，荧光基团与淬灭基团位于同一个DNA分子上，荧光基团被激发的荧光被淬灭基团吸收，荧光基团不发出荧光；而当探针被脱氧核糖核酸酶降解后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团能正常发出荧光。采用实时定量PCR仪检测反应体系中发出的荧光强度，即可判断反应体系中是否存在脱氧核糖核酸酶。本方法可广泛用于生物制品中脱氧核糖核酸酶残留的质量检测，或用于脱氧核糖核酸酶定量测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶检测领域，具体而言，涉及脱氧核糖核酸酶的检测方法及一种脱氧核糖核酸酶检测DNA探针和试剂盒。
技术介绍
脱氧核糖核酸酶(DNase酶)普遍存在于细胞中，参与了多种生理生化过程，例如DNA复制和修复、细胞凋亡等。其也可用作疾病的标志物，如在关节炎、肾炎患者体内，其DNA酶I表达水平低[Nadano,D.；Yasuda,T.；Kishi,K.MeasurementofdeoxyribonucleaseIactivityinhumantissuesandbodyfluidsbyasingleradialenzyme-diffusionmethod.Clin.Chem.1993,39,448–452.]；DNase酶也可用于疾病的治疗，如DNaseI可用于治疗囊性纤维瘤。传统的DNase检测方法包括高效液相色谱(HPLC)或酶联免疫吸附试验(ELISA)等。然而，这些方法普遍存在灵敏度不高，检测耗时，对仪器设备要求高等缺点。为解决上述问题，比色法、电化学方法等技术被开发出来。比色法是基于DNaseI裂解底物产生的短DNA片段可被凝胶电泳或分光光度法检测，该法虽然操作简单、成本低，但灵敏度较低；在电化学方法中，二茂铁基寡核苷酸被用于DNA酶检测；二茂铁是电化学活性的信号分子(Hillier,S.C.；Frost,C.G.；Jenkins,A.T.；Braven,H.T.；Keay,R.W.；Flower,S.E.；Clarkson,J.M.Anelectrochemicalstudyofenzymaticoligonucleotidedigestion.Bioelectrochem2004,63,307–310.)，DNA酶I使二茂铁从电极释放，电流下降，从而可利用伏安法检测DNA酶I活性。该法虽能达到较低的检测限，但其结果受电极修饰、操作环境等影响大，难以作为一种常规的检测技术。在大量的研究和生产中，需要稳定的DNA分子，即DNA分子需处于无DNase酶或对DNase酶含量有一定限制的环境中，因此，对脱氧核糖核酸酶残留与否的检测就非常重要，特别是急需一种简便、高灵敏、高通量的常规DNase含量检测方法，该检测方法可广泛用于检测生物制品(如BSA)、试剂、表面环境(如实验台，容器、仪器表面等)中的DNase酶等，确保研究的准确性和生产的稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于建立一种高灵敏度、高通量、简便常规的脱氧核糖核酸酶检测方法，能准确地检测不同样本中不同脱氧核糖核酸酶的活性及含量。本专利技术的另一目的在于提供一种包含茎环结构的DNA探针，该探针可用于脱氧核糖核酸酶定量检测。本专利技术的另一目的在于提供脱氧核糖核酸酶检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种DNA探针，其包含有一个茎环结构，且2个末端或内部分别连接有能量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移,所述DNA探针的碱基长度为15-50个核苷酸，且包含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的能量供体基团和能量受体基团在不同的探针片段上；所述茎环结构中，其茎结构包括位于探针两端的5～15bp的回文互补序列，其环结构包括长度为5-20nt的核苷酸序列，探针退火后形成发夹结构，两个回文互补部分Tm值大于35℃。优选茎区至少包括1个T，2个T，3个T，4个T，5个T，6个T；和/或环区至少包括1个A、1个C、1个T和1个G。在其中一个实施例中，所述DNA探针至少包括一个具脱氧核糖核酸酶抗性和/或提高酶解特异性的修饰的核糖核苷酸。能防止DNA探针被酶降解的核苷酸修饰方式都可以，能提高探针和酶反应的特异性修饰方式都适用本专利技术，优选核糖2-位修饰、磷酸骨架修饰。所述磷酸骨架修饰具体为硫代磷酸酯修饰、二硫代磷酸酯修饰、磷酸三酯修饰等。所述核糖修饰具体为2'-O-甲基核糖核苷酸、2’-F核糖核苷酸、2'-甲氧基乙氧基核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2'-O-烯丙基核糖核苷酸、2'-O-戊基核糖核苷酸或2'-O-丁基核糖核苷酸，更优选为：所述DNA探针的末端的核糖核苷酸为硫代磷酸核糖核苷酸。在其中一个实施例中，能量供体基团为荧光基团，能量受体基团为其对应的荧光淬灭基团。在其中一个实施例中，荧光基团和荧光淬灭基团选自FAM、TAMRA、HEX、CY染料、BQH、Dabcy1。在其中一个实施例中，所述DNA探针的碱基组成选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.8任一所示序列，也可以同时选择多条碱基组成如SEQIDNO.1-SEQIDNO.8所示序列构成的多条探针。一种脱氧核糖核酸酶的检测试剂盒，包括有上述的DNA探针。一种脱氧核糖核酸酶的检测方法，该方法包括以下步骤：1)制备如上述DNA探针作为底物；2)将样本与步骤1)中所述底物接触；3)PCR荧光定量检测，检测步骤2)接触反应后的底物的荧光强度。在其中一个实施例中，其步骤还包括在PCR荧光定量检测前反应体系中加入缓冲液，所述缓冲液成分包括0.01～5MNaCl,0.01～5MKCl,50mM～1MTris-HCl,10～100mMMgCl2，缓冲液的pH值6.5～9.0。优选0.3-2.5MNaCl，0.2-2MKCl，100mM-800mMTris-HCl，20mM-100mMMgCl2，优选500mMNaCl,200mMKCl,500mMTris-HCl,100mMMgCl2,pH8.0。检测样本可为试剂、水、体液或包含DNase酶的任何液体样本或可配置为液体的样本。优选DNA探针的浓度为0.01pmol/ul-10pmol/ul。优选的DNase酶为DNaseI，ExonucleaseI。本专利技术的方法基于荧光共振能量转移原理而建立：携带荧光基团和淬灭基团的寡核苷酸发生共振能量转移(FRET)，在加入DNA酶后，寡核苷酸底物被切割，荧光基团被释放，荧光强度可代表DNA酶含量。一般来说，DNase含量越高，探针被降解得越多，PCR荧光信号更强。本专利技术所述检测方法和检测试剂盒的体优势体现在：1)灵敏度高(可达0.0005U/ulDNaseI)；2)特异性好(只对DNase有作用，对RNase没有作用)；3)可高通量检测：能同时对大量样本进行检测；反应体积小，成本低，简单快速(可在1小时完成检测)，适宜实验室的常规质控需求；4)可实时观测；5)广谱性：可检测不同样本中，不同脱氧核糖核酸酶的含量和活性；6)安全本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA探针，其特征在于,其包含有一个茎环结构，且2个末端或内部分别连接有能量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移,所述DNA探针的碱基长度为15‑50个核苷酸，且包含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的能量供体基团和能量受体基团在不同的探针片段上；所述茎环结构中，其茎结构包括分别位于探针两端的5～15bp的回文互补序列，其环结构包括长度为5～20nt的核苷酸序列，探针退火后形成茎环结构，两个回文互补部分Tm值大于35℃。

【技术特征摘要】
1.一种DNA探针，其特征在于,其包含有一个茎环结构，且2个末端或
内部分别连接有能量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基
团之间能进行能量转移,所述DNA探针的碱基长度为15-50个核苷酸，且包
含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的能量供体基团和能量受
体基团在不同的探针片段上；
所述茎环结构中，其茎结构包括分别位于探针两端的5～15bp的回文互补序
列，其环结构包括长度为5～20nt的核苷酸序列，探针退火后形成茎环结构，
两个回文互补部分Tm值大于35℃。
2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述茎环结构中，其
茎结构包括至少一个T，其环结构包括至少一个1个A、1个C、1个T和1
个G。
3.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于,所述能量供体基团为
荧光基团，所述能量受体基团为其对应的荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的DNA探针，其特征在于,所述荧光基团和荧光
淬灭基团选自FAM、TAMRA、HEX、CY染料、BQH、Dabcy1。
5.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于,所述DNA探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，刘霭珊，曹亮，克雷格·梅洛，
申请(专利权)人：广州市锐博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44