【技术实现步骤摘要】
201510214642
【技术保护点】
一种基于荧光PCR的快速核酸测序法,采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段,上机进行双脱氧测序;基于本专利技术研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂:1)FTA卡1片;2)PCR反应液1管,内装SYBR GREEN荧光PCR反应液,包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的Buffer、SYBR GREEN溶液;上下游引物各1管,内装目标序列扩增及测序引物;双脱氧测序试剂一套,包括BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer (5×), BigDye Mix;测序产物纯化试剂一套,包括XTerminator solution、SAM solution各1管;去离子水1管,内装无DNA酶的灭菌去离子水;基于本专利技术建立的基于荧光PCR的快速测序方法,按下列步骤进行:1)FTA样品卡的制备细菌悬液经适当稀释后(大约6×104 至6×107 CFU/mL),吸取100ul滴于FTA卡上,室温晾干备用;2)SYBR Green实时荧光PCR直接扩增目标片段配制反应体系:按常规配制SYBR Green实时荧光PCR反应体系,加入上下游 ...
【技术特征摘要】
1.一种基于荧光PCR的快速核酸测序法,采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段,上机进行双脱氧测序;基于本发明研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂:
1)FTA卡1片;
2)PCR反应液1管,内装SYBRGREEN荧光PCR反应液,包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的Buffer、SYBRGREEN溶液;
上下游引物各1管,内装目标序列扩增及测序引物;
双脱氧测序试剂一套,包括BigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×),BigDyeMix;
测序产物纯化试剂一套,包括XTerminatorsolution、SAMsolution各1管;
去离子水1管,内装无DNA酶的灭菌去离子水;
基于本发明建立的基于荧光PCR的快速测序方法,按下列步骤进行:
1)FTA样品卡的制备
细菌悬液经适当稀释后(大约6×104至6×107CFU/mL),吸取100ul滴于FTA卡上,室温晾干备用;
2)SYBRGreen实时荧光PCR直接扩增目标片段
配制反应体系:按常规配制SYBRGreen实时荧光PCR反应体系,加入上下游引物的终浓度均为100ng/uL,用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片加入体系,终体积为20uL;
荧光PCR直接扩增:使用荧光定量PCR仪进行扩增,扩增反应条件为,95℃2min,[95℃10s,60℃20S,72℃40S(荧光采集)]35次循环,72℃10min;
PCR扩增效果评价:Cp(或Ct)值小于30且熔解曲...
【专利技术属性】
技术研发人员:蔡颖,周霓,周广彪,陈霖祥,魏锐,朱俊贤,吴烽,林昆,黄琦容,
申请(专利权)人:汕头国际旅行卫生保健中心,
类型:发明
国别省市:广东;44
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