一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，该方法利用连接酶连接与待测核酸互补的含有茎环结构的探针形成双茎环结构DNA模板，该模板可以引发快速、高效的环介导等温扩增反应，从而实现高灵敏度的核酸检测，同时该方法能够特异性地区分含有单碱基差异的核酸。本发明专利技术首次提出通过高特异性的连接反应构建双茎环结构DNA，为下一步环介导等温扩增反应提供了特异性的扩增模板，该方法无需荧光标记，成本低廉，避免了PCR过程精确的热循环过程，在恒温条件下即可实现待测核酸的快速扩增。本发明专利技术能够用于RNA或DNA的定量分析、甲基化检测、SNP检测等，为高灵敏的核酸分析及癌症早期诊断等研究提供了新的策略。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，该方法利用连接酶连接与待测核酸互补的含有茎环结构的探针形成双茎环结构DNA模板，该模板可以引发快速、高效的环介导等温扩增反应，从而实现高灵敏度的核酸检测，同时该方法能够特异性地区分含有单碱基差异的核酸。本专利技术首次提出通过高特异性的连接反应构建双茎环结构DNA，为下一步环介导等温扩增反应提供了特异性的扩增模板，该方法无需荧光标记，成本低廉，避免了PCR过程精确的热循环过程，在恒温条件下即可实现待测核酸的快速扩增。本专利技术能够用于RNA或DNA的定量分析、甲基化检测、SNP检测等，为高灵敏的核酸分析及癌症早期诊断等研究提供了新的策略。【专利说明】一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法
本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种基于连接反应构建双茎环结构DNA 模板的方法，以及该方法在RNA定量检测、DNA定量检测、甲基化检测以及单碱基区分中的应 用。
技术介绍
随着人类基因组计划的完成和新一代高通量测序技术的不断发展，特定序列核酸 (DNA或RNA)的变异检测、DNA甲基化分析、microRNA表达分析的研究，已成为分子生物学领 域研究的热点。他们被作为基因标志物，用于疾病的病理研究、早期诊断及药物的研发。因 此，简便、快速、灵敏、具有单碱基识别能力的DNA或RNA检测及定量分析方法对生命基本过 程的深入研究，基因相关遗传性疾病及癌症发生的研究，疾病的早期诊断及治疗都有非常 重要的意义。往往这些基因标志物的少量变异便可能引起疾病的发生，因此在生物样品测 定中不仅需要分析方法具有潜在的信号放大能力即高灵敏度，同时更需要具有良好的识别 DNA或RNA中单碱基差异的能力即良好的选择性。 目前以PCR为代表的核酸扩增技术是DNA和RNA检测及定量分析的重要手段。然而， PCR不仅需要精确的热循环，同时容易由引物二聚体产生假阳性的扩增信号，而且很难区分 DNA或RNA中的单碱基的差别。尽管等位基因特异性PCR被用于DNA单碱基差异的检测，然而 DNA聚合酶识别单碱基错配的特异性很难满足大量未突变碱基中少量的突变。随着分子生 物学的猛烈发展，以等温核酸扩增技术为基础的核酸检测技术相继建立，如链顶替核酸扩 增技术(SDA)、滚环扩增技术(RCA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、切刻内切酶核酸等温扩增 技术(NEMA)等。这些技术摆脱了 PCR对精良仪器设备的依赖，使等温核酸扩增技术在临床和 现场快速诊断方面显示其突出的优越性，但在单碱基分辨能力上这些方法存在很多不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种以待测核酸序列为模板，利用连接酶连 接与待测核酸互补的含有茎环结构的探针形成双茎环结构DNA，以该双茎环结构DNA作为起 始模板引发快速、高效的环介导等温扩增反应，从而实现高灵敏地检测核酸的方法，特别是 特异性地区分含有单碱基差异的核酸。 解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成： 1、根据待检测核酸序列，设计并合成具有茎环结构的探针A和探针B，其中探针A从 端到端依次为茎环区、检测识别区，探针B从端到端依次为检测识别区、茎环区且 其序列的5'端修饰磷酸基团，所述探针A和探针B的检测识别区是与待检测核酸互补的8~ 40个碱基序列。 2、将探针A、探针B的检测识别区与待检测核酸杂交，然后通过连接酶将探针A和探 针B连接起来形成双茎环结构DNA。 3、以双茎环结构DNA为模板进行环介导等温扩增反应，并加入SYBR Green I荧光 染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线即可实现核酸的检测及定量分析。 上述的待检测核酸为RNA时，所述的连接酶为T4RNA连接酶2、T4DNA连接酶、T3DNA 连接酶中的任意一种，探针A和探针B的检测识别区优选与RNA互补的9~22个碱基序列。 上述的待检测核酸为DNA时，所述的连接酶为ArrtpligaseK^稳定型DNA连接酶、 Taq DNA连接酶、9° N? DNA连接酶中的任意一种，探针A和探针B的检测识别区优选与DNA互 补的15~25碱基序列。 上述的探针A和探针B进一步优选茎环区的茎的长度为5~18个配对的碱基序列， 茎环区的环的长度为15~35个碱基序列。本专利技术的有益效果如下： 1、本专利技术首次提出利用连接反应构建双茎环结构DNA模板，该方法不需要荧光标 记，成本低廉，检测不需要放射性元素标记，避免了对人体的放射性危害。 2、本专利技术通过高特异性的连接反应构建的双莖环结构DNA为下一步环介导等温扩 增反应提供了特异性的扩增模板，可以实现RNA定量分析(如基因表达分析、microRNA表达 分析）、DNA定量分析、甲基化检测、SNP检测等。 3、本专利技术的连接反应和环介导等温扩增反应均在离心管中依次完成，所建立的核 酸检测方法无需复杂的分离和洗涤步骤，减少了实验过程中试剂交叉污染的风险，简化了 实验操作步骤，提高了检测的灵敏度。该方法为高灵敏的核酸分析及癌症早期诊断等的研 究提供了新的策略。 4、本专利技术方法相对于PCR，克服了升降温过程耗时的缺点，实现了恒温条件下的信 号快速放大，具有高的灵敏度和扩增效率。 5、本专利技术方法还可通过终点荧光检测、共振光散射检测、凝胶电泳检测等检测手 段进行RNA定量分析(如基因表达分析、microRNA表达分析）、DNA定量分析、甲基化检测、SNP 检测等。【附图说明】图1是探针A和探针B的结构示意图。 图2是实施例1中基于连接反应构建双茎环结构DNA模板定量检测microRNA的原理 示意图。 图3是实施例1中荧光强度随着let_7a浓度变化的实时荧光曲线图。 图4是实施例1中检测let_7a实时荧光曲线P0I值与let_7a浓度对数值的线性关系 图。图5是实施例2中基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测let-7家族的相对信 号强度图。图6是实施例3中基于连接反应构建双茎环结构DNA模板定量检测p53基因DNA片段 的原理示意图。 图7是实施例3中荧光强度随着DNA浓度变化的实时荧光曲线图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于 这些实施例。 实施例1 以let-7a为microRNA分析模型，根据let-7a序列5' -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3 '，设计合成具有茎环结构的探针A和探针B，探针A的碱基序列为5 '-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTAACTATACAAC-3'(由宝 生物工程（大连）有限公司提供）；探针B的碱基序列为5 '-CTACTACCTCATTTTATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGAT-3'(由宝 生物工程(大连)有限公司提供），其中探针B的5'端修饰磷酸基团。探针A和探针B的结构示 意图如图1所示。 如图2所示，当存在let_7a时，探针A和探针B的检测识别区分别与let_7a特异性杂 交，以let-7a为模板，在T4RNA连接酶2催化作用下将探针A和探针B连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，其特征在于它由下述步骤组成：(1)根据待检测核酸序列，设计并合成具有茎环结构的探针A和探针B，其中探针A从5′端到3′端依次为茎环区、检测识别区，探针B从5′端到3′端依次为检测识别区、茎环区且其序列的5′端修饰磷酸基团，所述探针A和探针B的检测识别区是与待检测核酸互补的8～40个碱基序列；(2)将探针A、探针B的检测识别区与待检测核酸杂交，然后通过连接酶将探针A和探针B连接起来形成双茎环结构DNA；(3)以双茎环结构DNA为模板进行环介导等温扩增反应，并加入SYBR GreenI荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线即可实现核酸的检测及定量分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李正平，王辉，王洪红，孙圆圆，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61