重组人脱氧核糖核酸酶I的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法。本发明专利技术提供了质粒载体、工程菌、由工程菌发酵产生重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的方法，由该方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ及其应用与药物。本发明专利技术实现了rHuDNase I在毕赤酵母中的分泌表达，保证了与人体rHuDNase I结构的相似性，所得产物活性高达2677IU/mg，表达量高达87mg/L，纯度近乎为100％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法。
技术介绍
随着气候环境的变化及和生活方式的改变，现代人患呼吸道疾病的机率越来越大，人群分布也越来越多。呼吸系统疾病近年来成为一种常见病、多发病，世界范围内其发病率都较高，并有增加的趋势，它是我国人口死亡的第二大因素，而且，65岁以上老人因呼吸系统疾病死亡占相当大的比例。以慢性支气管炎为例，据统计，我国50岁以上中老年人发病率为15％～30％左右。喘、咳、痰、炎四症是呼吸系统疾病常见症状，同时互为因果。痰是呼吸道炎症的产物，可刺激呼吸道粘膜，引起咳嗽及哮喘，并可加重感染。急慢性支气管炎或慢性肺病患者呼吸衰竭时，如病人痰液粘稠度过高或形成痰栓，可阻塞呼吸道而导致窒息。目前对该病的治疗原则是抗炎，化痰，止咳，其中化痰药主要包括恶心性和刺激性祛痰药，痰液溶解剂和黏液调节剂，10年市场总销售额约为31亿，其中排名前五位的氨溴索约占市场份额的80％多，乙酰半胱氨酸、复方可待因、复方右美沙芬、愈创木酚甘油醚各占3％左右。这些祛痰药的基理是对胃黏膜及呼吸道黏膜进行刺激而增加呼吸道的分泌物，使痰液变稀，或者作用于气管和支气管的黏液产生细胞，使分泌物黏滞性降低。但这些药物的药理或临床上存在一些缺陷，这主要是由于其分子结构中游离的巯基会吸附胃肠道粘蛋白，口服后会产生胃肠道局部损伤，副作用较大，患者使用多有不良反应，会伴有恶心、呕吐、胃肠道出血等症状。并且，这些祛痰药会减弱青霉素、头孢类抗生素、红霉素、四环素等的抗菌活性，不宜联合用药，对某些呼吸参数如痰粘度等的改善效力不高等，故限制了患者对该类药的长期口服治疗。市场迫切需求一种新的安全有效的痰液降解剂问世。重组人脱氧核糖核酸酶I(rHuDNaseI)可直接作用于痰液中的主要粘性成分DNA，改变分泌物的组成和流变学性质，降低痰液粘度，改善受抑制的呼吸功能。对囊性纤维化病人形成的顽固呼吸道分泌物的临床治疗显示，rHuDNaseI对病人粘液的降解及肺功能的改善效果显著，并可长期安全使用。尽管该药物上市的定位是针对囊性纤维化病人，但调查结果显示，其它呼吸道疾病患者对该药的需求呈快速上升趋势，rHuDNaseI在未来祛痰药市场上将具有广阔的市场发展空间，它不但会为临床祛痰药物带来新的选择，而且随着其市场推进发展，也必将会改变目前祛痰药市场的格局。2010年，该药在全球的销售总额达到25.2亿，预计2015年将达到37.3亿。但是目前，该药价格非常昂贵。究其原因，是由于rHuDNaseI的生产效率十分的低。目前，对rHuDNaseI的制备方法主要通过细菌或哺乳动物细胞表达。哺乳动物细胞对重组蛋白的表达效率较低。细菌表达虽然能够提高重组蛋白的产量，但氨基酸链在折叠过程中却容易出现问题，导致制备的重组蛋白活性较低或彻底失活。因此，进一步开发表达量大、蛋白活性高的rHuDNaseI的制备方法，具有重大的经济和社会意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法。该方法所得蛋白量较大，蛋白活性较高。本专利技术提供了表达载体，其以pPIC9载体为骨架其中包括rHuDNaseI基因。pPIC9载体的质粒图谱如图1；pPIC9载体为毕赤酵母的蛋白表达载体，其为融合表达载体，表达水平为高拷贝，启动子为AOX1；抗性标记为氨苄霉素，营养标记为HIS4；可选用的酶切位点为XhoI，SnaBI，EcoRI，AvrII，NotI。本专利技术将rHuDNaseI基因的5’端链接有6×His标签。本专利技术选择的rHuDNaseI基因的插入位点为XhoI与NotI酶切位点之间。所述rHuDNaseI基因的来源为人肝cDNA文库。基因片段的长度为0.85kb。本专利技术构建的载体能够将rHuDNaseI基因插入毕赤酵母GS115的his4区，从而使rHuDNaseI基因能够顺利的表达。所述表达载体在转化入酵母菌前，转化入大肠杆菌DH5α进行扩增和保存。本专利技术还提供了一种工程菌，其为转化本专利技术所述表达载体的酵母菌。本专利技术采用的酵母菌为毕赤酵母GS115。所述转化采用电转化，转化条件为1500V，5ms。所述转化前，表达载体经线性化，所述线性化的酶SalI。所述转化后，采用MD固体培养基筛选阳性转化子；每升MD固体培养基中包括葡萄糖20g，YNB13.4g，生物素0.4mg；琼脂20g；筛选培养的温度为28℃。倒置培养。经培养，MD固体培养基上生长的转化子经DNA测序，PCR检测，验证成功插入rHuDNaseI基因。本专利技术还提供了重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法，其为发酵本专利技术提供的工程菌。本专利技术中，发酵前还包括种子活化的步骤。所述活化采用BMGY培养基。发酵的培养基为BMDY培养基。每升BMGY培养基中含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10g，生物素0.4mg。每升BMDY培养基中含酵母提取物15g，蛋白胨30g，YNB13.4g，葡萄糖40g，生物素0.4mg，硫酸铵2g。本专利技术中，发酵包括培养和诱导的步骤；所述发酵在发酵罐中进行。所述培养的温度为30℃，搅拌速度为150rpm～300rpm；培养至菌体体积为10％。菌体体积是指为离心以后菌体所占培养液的体积。所述诱导的诱导剂为甲醇，温度为25℃～30℃，搅拌速度为200rpm～450rpm。具体的，开始诱导后2h温度为30℃；搅拌转速为250rpm；诱导后2～4h，温度由30℃降至25℃，转速由250rpm升至450rpm；诱导后4h至诱导结束，温度为25℃；转速为450rpm。所述诱导剂的加入采用流加方式，其占培养基体积的1％。所述发酵过程pH值为6.0。所述发酵步骤中，溶氧呈现先下降再升高后又下降的趋势；其波动范围为20％～90％；具体的，在培养的过程中，溶氧由80％下降至20％，后又升高至90％；诱导过程中，溶氧由90％下降至35％。本专利技术所述溶氧量为：即时溶氧量所占初始溶氧量的百分比，定义充分通气时的溶氧量为100％。本专利技术中，发酵步骤持续108h，其中，转速、溶氧、温度、菌体密度、pH值参数如图4所示。经过发酵，所得重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ存在于培养液中。发酵后进行纯化，所述纯化采用镍柱层析。所述纯化包括：步骤1：收集发酵上清液经稀释后、调整pH值为7.2，离心后取上清液上样镍层析柱；步骤2：平衡镍层析柱后，以洗脱液洗脱，收集rHuDNaseI。所述平衡的缓冲液中，包括50mMNaH2PO4、300mMNaCl、20mMimidazole，其pH值为8.0。所述平衡缓冲液的体积为层析介质体积的10倍。所述洗脱液中，包括50mMNaH2PO4、300mMNaCl、500mMimidazole，其pH值为8.0。所述洗脱液的体积为层析介质体积的5倍。将分离纯化的rHuDNaseI重组蛋白以SDS-PAGE检测，其分子量约为37kDa；以程序Gel-ProAnalyzer图像扫描分析，纯度近乎100％；分别测定纯化后的rHuDNaseI重组蛋白活性浓度，计算出其比活性为2677IU/mg。本专利技术所述制备方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ。本专利技术所述制备方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ在制备治疗呼吸道疾病的药物中的应用。实验表明，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，其特征在于，以pPIC9载体为骨架，其中包括rHuDNase I基因。

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特征在于，以pPIC9载体为骨架，其中包括rHuDNaseI基因。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述rHuDNaseI基因连接有6×His标签；所述rHuDNaseI基因的插入位点为XhoI与NotI酶切位点之间。3.一种工程菌，其特征在于，其为转化权利要求1或2所述表达载体的酵母菌。4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述酵母菌为毕赤酵母GS115。5.重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法，其特征在于，发酵权利要求3～4任一项所述的工程菌。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养基为BMDY培养基。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵包括培养和诱导的步骤；所述培养的温度为30℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：田国樑，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31