拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶及其制备方法与应用技术

拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶及其制备方法与应用，涉及双链特异性脱氧核糖核酸酶。制备方法：提取拟穴青蟹肝胰腺总RNA；用RT-PCR技术从总RNA中拟转录得到cDNA；利用SMART?II-RACE的方法得到新的DSN基因；利用基因重组的方法，构建拟穴青蟹原核表达重组质粒；在大肠杆菌里面高效表达并纯化出具有生物活性的重组拟穴青蟹DSN。提供一种重组载体，该载体包括所述拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的基因序列。提供一种生物制剂，该生物制剂含有所述拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶，所述生物制剂应用于降解双链DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及双链特异性脱氧核糖核酸酶，特别涉及拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶及其制备方法与应用。
技术介绍
拟穴青蟹(Scylla paramamosain),隶属节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，是印度洋、太平洋热带海域的重要养殖蟹种，在我国浙江、福建、广东、海南省广泛养殖。双链特异性脱氧核糖核酸酶(Duplex-Specific Nuclease,以下简称为DSN)是2004年从堪察加拟石蟹(Paralithodes camtschaticus,俗名:帝王蟹)肝胰腺中发现的一种热稳定核酸酶，该酶能够降解双链DNA和DNA-RNA的杂交体中的DNA而对单链核酸分子几乎没有作用。另外，DSN对完全互补配对的短片段双链DNA (8 12bp)具有很高的酶切活性，而对于不完全互补配对的短片段双链DNA的酶切活性很低。DSN的酶活性要在有二价金属阳离子如Mg2+的条件下才发挥作用，最佳的pH为7.0-8.0 ;最适温度为55 65°C;可以用10mmol/L EDTA终止酶切反应，在37°C时对蛋白酶K有耐受性。基于DSN具有以上这些特点，虽然DSN发现的比较晚，但是一经面世，很快被EVR0GEN公司制成了商品 ，广泛的应用于分子生物学研究中。同时，已经在美国等地方申请相关的专利(US7951569B2、US20050164216A1 等)。目前，DSN主要有以下应用:均一化文库构建:Zhulidov( Zhulidov PA, Bogdanova EA, Shcheglov AS, etal.Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex_specific nuclease.Nucleic Acids Research, 2004, 32: e37)首次把DSN用于全长cDNA的均一化文库构建，并成功地构建了美国加州海兔(Aplysia califomica)神经组织的均一化全长cDNA文库。使用DSN作为工具特异降解双链DNA，避免了以往cDNA文库均一化过程中需要靠物理方法分离单、双链DNA的繁琐步骤。DSN均一化cDNA文库原理和步骤如下:cDNA文库先变性，再复性，因为丰度高的DNA复性快，而丰度低的DNA复性慢，rRNAURNA来源的DNA分子复性速度快于mRNA，首先被DSN降解，通过各种来源的DNA分子的复性速度的不同来进行均一化。DSN均一化处理能够降解高丰度的来自rRNA、tRNA、管家基因的DNA分子，而保留低表达丰度的DNA分子。DSN能减低高丰度表达基因100倍以上，有效富集低丰度表达基因。米用DSN 均一化技术与 SMART (Switching mechanism at5，end of RNAtranscript)建库技术相结合的方法,构建均一化全长cDNA文库已经有广泛的应用，包括人的一些组织、海兔(Aplysia californica)的神经组织、锯缘青蟹性腺、锯缘青蟹卵巢、大黄鱼(Larimichthys crocea)卵巢、杂色鲍(Haliotis d iversicolor supertexta)月干膜腺、鸭(Anas platyrhynchos)早期胚胎、亚洲棉(Gossypium arboreum L.)、杀虫真菌金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.acridum)、堇菜(Viola verecumda A.Gray)叶片坐寸O基于DSN对完全互补的短片段双链DNA (8 12bp)具有很高的酶切活性，而对于不完全互补的短片段双链DNA的酶切活性很低的特点，广泛用于单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)的检测和分析。另外,DSN还用于染色体端粒数量的测定、RNA测序、多重复序列的基因组鸟枪法测序、从cDNA中分离微卫星DNA、单个细胞测序、低表达基因的检测等方面。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶。本专利技术的第二目的在于提供一种拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的制备方法。本专利技术的第三目的在于提供拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的应用。所述拟 穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的基因序列为: acgggggtga aagagggagt gtggagagtg cagcagacga aatggagctt gagcgaggaa 50 tcttcacgca cttcgtttta atcaccattt tctccgcctg tgtctactgt tcggactgcg 120 tgtggaacaa agacaaggac ttccctcaat acccaccgct catcctcgat tccagtttcg 180 agtttgtact gccggtggag gaggatggca acagggtggt cagggtggcg gcgggagaga 240 ccgtgactct ggcatgtcca ggcgacgaga tcgaaaactt gcatcaggtg gaggcggagg 300 ctcgctgtct cgagaacggc ctcctggcta tcgaaaactc agagtgggat atggcgagcc ibU权利要求1.一种拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶，其特征在于，所述拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的基因序列为:2.一种拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶，其特征在于，所述拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的氨基酸序列为: Met Glu Leu Glu Arg Gly He Phe Thr His Phe Val Leu He Thr Ile1510153.一种拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)提取拟穴青蟹肝胰腺总RNA； 2)用RT-PCR技术从总RNA中拟转录得到cDNA； 3)利用SMARTII-RACE的方法得到新的DSN基因； 4)利用基因重组的方法，构建拟穴青蟹原核表达重组质粒； 5)在大肠杆菌里面高效表达并纯化出具有生物活性的重组拟穴青蟹DSN。4.一种表达拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的重组载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求I所述的拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的基因序列。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是中间插有6个His的亲和标记位点的高效表达载体pET-32a。6.一种含有如权利要求5所述重组载体的原核细菌。7.如权利要求6所述的原核细菌，其特征在于，所述原核细菌为大肠杆菌。8.—种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂含有如权利要求2所述的拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶。9.如权利要求8所述生物制剂在降解双链DNA上的应用。全文摘要拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶及其制备方法与应用，涉及双链特异性脱氧核糖核酸酶。制备方法提取拟穴青蟹肝胰腺总RNA；用RT-PCR技术从总RNA中拟转录得到cDNA；利用SMA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶,其特征在于，所述拟穴青蟹双链特异性脱氧核糖核酸酶的基因序列为：FDA00003241220400011.jpg

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王艺磊，张子平，兰旺仁，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：