本发明专利技术提供一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法，其步骤为：对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中的细菌进行分离；对分离菌株进行DNA的提取；利用通用引物FA‑27F：5'‑AGTCTCTGATCATGCCTCAG‑3'和RA‑1492R：5'‑AAGGAGGTGCTCCAGCC‑3'，进行16S rDNA序列的PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测；对步骤(3)16S rDNA序列PCR扩增产物进行测序；将获得菌株的16S rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全领域，具体涉及一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法。
技术介绍
婴幼儿配方乳粉作为母乳的首要替代物，是婴幼儿重要的摄食来源，为婴幼儿健康成长和发展提供几乎全部的蛋白质、脂质、维生素、矿物质等营养物质。婴幼儿配方乳粉要求是一个无有害菌的产品，而其生产所用的原辅料容易污染细菌，其生产过程也并不是一个绝对无菌的环境。正是由于加工过程中这种非绝对无菌特点，导致婴幼儿配方乳粉可能被来源于原辅料以及生产过程中的病原菌污染，进而对婴幼儿健康产生不良影响。目前对婴幼儿配方乳粉中细菌的防控局限于对成品或原辅料、生产环境的单一检测单一防控，不能达到从根源上追溯成品中细菌来源，针对性防控的目的。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法，达到从根本上针对性防控细菌的方法。包括以下步骤：1)对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中的细菌进行分离；2)对分离菌株进行DNA的提取；3)利用通用引物FA-27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和RA-1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，进行16SrDNA序列的PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测；4)对步骤(3)16SrDNA序列PCR扩增产物进行测序；5)将获得菌株的16SrRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。具体步骤为：(1)对婴幼儿配方乳粉的原辅料、生产环境空气、生产环境表面进行取样；富集培养分离细菌；(2)按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒要求的具体方法对分离菌株进行DNA的提取；(3)16SrDNA序列的PCR扩增：利用通用引物FA-27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和RA-1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，进行序列的扩增。PCR扩增体系为：16μL2×TaqPCRMasterMix，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，30μLddH2O。扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃末端延伸7min；取5μLPCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，电压为5V/cm，电泳液为1×TAE，添加溴化乙锭(EB)染色后电泳30min，在凝胶成像系统下观察电泳条带情况；(4)将步骤(3)得到的16SrDNA序列的PCR扩增产物进行测序；(5)将获得的16SrRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。附图说明图1婴幼儿配方乳粉加工流程图；图2部分分离菌株的DNA提取电泳鉴定；图3部分分离菌株的PCR扩增产物电泳图:M：markerDL2000；1～10：分离菌株PCR产物；图4肺炎克雷伯菌的16SrRNA基因序列的系统发育树:(菌株的分离来源：A26-原料乳，A25-原料乳乳，A22-原料乳，A5-乳清粉，A1-乳清粉，A4-乳清粉，A6-矿物质，A16-营养素，A17-营养素，A28-酪蛋白磷酸肽，A18-碳酸钙)；图5基于操作分类单元(97％相似水平)相对含量的12样品中细菌群落结构分布图；图6冬季各样品中细菌在属水平上的分布；图7夏季各样品中细菌在属水平上的分布.具体实施方式以下实施例使用主要生化试剂如表1所示。表1本实验主要生化试剂所用的主要仪器设备及软件如表2所示。表2仪器设备和软件实施例1样品采集研究中所用的所有样品(原辅料样品、空气样品、表面涂抹样品)，均由本实验室人员分别于冬季(2014年11月)和夏季(2015年6月)采集自某婴幼儿配方乳粉加工厂。原辅料样品信息见表3，每类样品每次采集三份。表3婴幼儿配方乳粉原辅料空气样品和表面涂抹样品采集地区见婴幼儿配方乳粉加工流程图图1，共6个采样地区，包括5个室内地区以及1个室外地区。其中室内地区涵盖了婴幼儿配方乳粉加工过程的主要环节，包括前处理环节(A)、生产环节(B)、生产内包环节(C)、包装内包环节(D)、包装环节(E)；室外地区(F)作为参考地点。在2014年11月和2015年6月，每个月进行三次样品采集，每次取样时间间隔为10天。经过2个月6次的样品采集，收集了14类，共84份婴幼儿配方乳粉原辅料，详细信息见表3。针对粉状样品(α-乳白蛋白、乳清粉、酪蛋白磷酸肽、碳酸钙、营养素、乳糖、氯化钾、维生素、核苷酸、矿物质、低聚果糖和乳铁蛋白)，每类原辅料无菌采集约200g；针对液体样品(原料乳和棕榈油)，每类原辅料无菌采集约200mL。收集到的原辅料立即放在低温采样箱中保存。表面涂抹样本采集：利用被无菌磷酸盐缓冲液(PBS)润湿的无菌棉签涂抹6个不同地区的待检区域表面(包括仪器设备、人员手、衣服、鞋底以及地面)，面积大小约为30m2，采集完毕后，放入到盛有PBS的15mL离心管中，4℃保存。实施例2细菌的分离：原辅料样品分别称取25g婴幼儿配方乳粉原辅料样品于灭菌后的225mLBPW三角瓶中，充分混合，取1mL混合液加入到9mL无菌PBS中，混匀后取1mL加入到另一9mL无菌PBS中，以此类推进行梯度稀释，选择合适的稀释梯度，每个稀释梯度分别吸取100μL混液均匀涂布于TSA固体培养基上，每个样品3个平行，于37℃恒温培养箱中培养24h，选取表观形态不同的单一菌落于LB液体培养基中，混匀后于37℃培养箱中培养24h。针对非单一菌落需进行纯化处理，首先用接菌环蘸取震荡后的过夜培养的LB菌液，在TSA固体培养基上进行三区划线，37℃倒置培养24h。然后挑取单菌落，重新置于液体LB培养基中进行纯培养，连续传代2次后进行后续试验。表面涂抹样品取出4℃下保存的表面涂抹样品，涡旋混匀，经无菌PBS进行梯度稀释，选择合适的稀释梯度，每个稀释梯度吸取100μL的稀释液均匀涂布于TSA固体培养基上，每个样品3个平行，然后放置于37℃恒温培养箱中培养24h，选取表观形态不同的单一菌落于LB液体培养基中，震荡混匀后于37℃培养箱中过夜培养。非单一菌落的纯化方式同上，选择混浊的培养基进行后续实验。收集的14类，共84份婴幼儿配方乳粉原辅料，经前期适当稀释、培养，挑取固体培养基TSA上菌落形态不同的单一菌落后，进一步分离、纯化处理，共分离出56株，其中冬季分离出36株，主要是原料乳中11株、乳清粉中8株、矿物质中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白磷酸肽中2株、碳酸钙中3株、营养素中3株和核苷酸中2株；夏季分离出20株，包括原料乳中7株、乳清粉中3株、营养素中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白磷酸肽和核苷酸中各2株。实施例3细菌鉴定：基因组DNA提取对于婴幼儿配方乳粉原辅料样品以及表面涂抹样品，分别取2mL分离菌株的LB液体菌液，按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒要求的具体方法对分离菌株进行DNA的提取。利用细菌基因组DNA提取试剂盒对分离的细菌进行DNA提取，并在1％的琼脂糖凝胶电泳上检测，部分结果如图2所示。从图中可以看到，提取的分离菌株DNA只有一条清晰的条带，没有其他杂带干扰，说明DNA的提本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法，其特征在于：步骤如下：(1)对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中的细菌进行分离；(2)对分离菌株进行DNA的提取；(3)利用通用引物FA‑27F：5'‑AGTCTCTGATCATGCCTCAG‑3'和RA‑1492R：5'‑AAGGAGGTGCTCCAGCC‑3'，进行16S rDNA序列的PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测；(4)对步骤(3)16S rDNA序列PCR扩增产物进行测序；(5)将获得菌株的16S rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。
【技术特征摘要】
1.一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法，其特征在于：步骤如下：(1)对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中的细菌进行分离；(2)对分离菌株进行DNA的提取；(3)利用通用引物FA-27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和RA-1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，进行16SrDNA序列的PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测；(4)对步骤(3)16SrDNA序列PCR扩增产物进行测序；(5)将获得菌株的16SrRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述原辅料、生产环境中的细菌来源于原辅料、生产环境空气、生产环境表面，所述分离为富集培养分离。...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，满朝新，娄彬彬，潘瑞丽，周彦宏，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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