一种用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法，该方法以人基因组DNA为样本，设计合成一对特异性引物，该特异性引物，具有与目的模板的三重结合特异性，按照一定的PCR扩增体系与PCR反应条件进行PCR扩增，检验位于Sipa1基因启动子区的CpG岛的甲基化水平的高低。本发明专利技术简单快捷，可对大批病例样本中Sipa1基因启动子的甲基化水平进行检测，将为乳腺癌等癌症的检测与发现、新药筛选与研制、治疗与效果评价提供一种技术方法，可以用于医学、药学及肿瘤生物学等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法
本专利技术涉及与癌细胞转移相关的Sipa1(signal-inducedproliferation-associating1)基因启动子甲基化水平的检测，具体地说，涉及一种利用一对特异性引物进行Sipa1基因启动子区域甲基化水平的检测，进而推断Sipa1蛋白在测定样本中的表达水平，将为乳腺癌等癌症的早期检测与发现、新药筛选与研制、治疗与效果评价提供一种技术方法，可以用于医学、药学及肿瘤生物学等领域。
技术介绍
癌症是当今对人类伤害最大的疾病，人群多，存活率低，难以治疗。其中乳腺癌是女性中最常被诊断的癌症，早期诊断和精准治疗是提高生存率、降低复发的关键。已有研究表面，Sipa1蛋白与多种正常组织的病变和癌细胞的增殖、粘附、浸润、转移等密切相关，会促进乳腺癌的发生、浸润与转移，同时也有报道证明Sipa1蛋白与结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌和黑色素瘤等癌症的转移、浸润、增殖或移动等相关。Sipa1蛋白即信号诱导增殖相关蛋白1，Sipa1基因由16个外显子组成，其翻译的蛋白由1042个氨基酸构成，是一个Rap1GAP(Rap1GTPaseactivatingprotein)蛋白，它可以催化Rap1蛋白从活化的Rap1GTP形式转变为失活Rap1GDP形式，实现对Rap1蛋白功能的调节，进而调控细胞的粘附、细胞内激酶的活性、以及对细胞核内基因的调控等。此外，Sipa1蛋白除了与癌症特征相关外，研究者们还发现Sipa1基因上存在两个单核苷酸多态性SNP位点，即rs931127和rs3741378，它们与宫颈癌的转移、非小细胞肺癌和乳腺癌的存活及发病密切相关。关于Sipa1蛋白的检测，一直限于传统的免疫印迹(WesternBlotting)，实时定量逆转录PCR(RT-PCR)等方法，这些方法的优点是能够准确检测到Sipa1蛋白的表达水平，但存在对仪器精密程度要求高、检测所需时间长等问题，而本专利技术所提供的方法具有准确度高、耗时短的优点，将为Sipa1蛋白表达水平提供一种新的低成本检测方法，为乳腺癌等癌症的检测与发现、新药筛选与研制、治疗与效果评价提供一种新的技术方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法，以克服上述不足。所述用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法包含一对特异引物序列设计(图5)。所述引物序列具有三重结合特异性，它可以与没有经过任何处理的DNA序列相互结合延伸，也可以和经过甲基化试剂处理的发生甲基化的DNA序列或是没有发生甲基化的DNA序列相互结合延伸，从而可以识别位于CpG岛的胞嘧啶是否发生甲基化，进一步判断Sipa1基因的甲基化水平，然后推断Sipa1蛋白的表达水平。引物序列设计的原理是首先观察目的产物所在的序列区域，然后根据理想的甲基化DNA序列设计引物序列，所设计的引物具有与正常DNA序列相互互补的碱基，也有与经过甲基化试剂处理的发生甲基化的DNA序列或是没有发生甲基化的DNA序列碱基相补，同时也有与上述三者不相互补的碱基结构，但是相互互补的碱基占大多数，不相互补的碱基占少数，这样可以确保所设计的引物与上述三类的模板都相互结合延伸。所述引物能够与Sipa1基因启动子序列特征靶位结合，而对其它基因序列无特异性结合。所述用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法包含一套相适应的标准化操作流程和步骤，它确保检测的准确性和检测效率。上述标准化操作流程与步骤包含如下5步：(1)提取人基因组DNA样本，DNA浓度为500ng/μL，纯度介于1.8<DNA260/280<2.0之间；(2)设计合成一对特异性引物，它应遵循上面所述的引物设计原则；(3)将提取到的DNA样本按照EZDNAMethylation-GoldTMKit的说明书进行甲基化处理；(4)以步骤(3)中处理后的DNA样本为模板，采用步骤(2)合成的特异性引物，按图6给定的体系和图7给定的条件进行PCR扩增，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，识别扩增产物，与预期片段大小一致；所述用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平方法的PCR扩增体系为：基因组DNA模板浓度为500ng/μL，体积为4μl，特异性引物Sipa1-Meth-F浓度为10μM，体积为1μl，特异性引物Sipa1-Meth-R浓度为10μM，体积为1μl，MIX溶液体积为10μl，ddH2O体积为4μl。所述用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平方法的PCR反应条件为：i.预变性温度为95℃，维持时间10min；ii.变性温度为95℃，维持时间20s；iii.退火温度为59℃，维持时间20s；iv.延伸温度为72℃，维持时间20s；v.重复(ii)-(iv)操作不低于35个循环；vi.维持温度为72℃，维持时间10min；vii.保持温度为4℃，维持时间小于20h。进一步，只有采用步骤(i)-(vii)的流程方法才可扩增出特征明显的高产量的PCR产物，用于序列确定及甲基化水平检测。(5)将扩增后的PCR产物回收、纯化，进行DNA测序，将所得序列与已公开数据库序列进行比对，确定此DNA片段为Sipa1基因启动子区域，进而获取Sipa1基因甲基化信息。本专利技术简单快捷、准确、重复性好，可高通量检测肿瘤病人样本中Sipa1基因启动子的甲基化水平，将为乳腺癌等恶性肿瘤的早期检测与发现、新药筛选与研制、治疗与效果评价提供一种技术方法，适用于医学、药学及肿瘤生物学等领域。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步具体说明。图1是MDA-MB-231和MDA-MB-361细胞系PCR产物电泳结果。图2是MDA-MB-231细胞Sipa1基因启动子甲基化序列测定结果。图3是MDA-MB-361细胞Sipa1基因启动子甲基化序列测定结果。图4是MDA-MB-231和MDA-MB-361细胞的SIPA1蛋白表达结果。图5为特异性引物序列。图6为PCR扩增体系。图7为PCR反应条件。具体实施方式下面借助实例和附图更加详细地说明本专利技术，但不应理解为本专利技术上述主题内容仅局限于下述实施例。在不脱离本专利技术上述技术思想和所公开精神的情况下，根据本领域普通技术知识与惯用手段，做出各种等效、替换、修改或变更，都落入本专利技术保护的范围。为说明本技术专利技术，以乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-361细胞系为例来具体阐述具体实施方式。第一步：从MDA-MB-231和MDA-MB-361细胞系里提取它们的基因组，调整DNA浓度为500ng/μL，纯度介于1.8<DNA260/280<2.0之间；第二步：合成图5中特定DNA序列的引物，通过PCR进行引物特异性检测，模板为MDA-MB-231和MDA-MB-361细胞系基因组DNA；第三步：将提取到的DNA样本按照EZDNAMethylation-GoldTMKit的说明书进行甲基化处理；第四步：以第三步中处理后的MDA-MB-231和MDA-MB-361DNA样本为模板，采用第二步中合成的特异性引物，按照图6和图7给出的反应体系和反应条件进行PCR扩增，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，识别扩增产物，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测Sipa 1基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取人基因组DNA样本，DNA浓度为500ng/μL，纯度介于1.8<DNA260/280<2.0之间；(2)设计合成一对特异性引物，该特异性引物既能够与没有经过甲基化试剂处理的基因组DNA序列结合，也能够与经过甲基化试剂处理后发生甲基化的基因组DNA序列、或者经过甲基化试剂处理而没有发生甲基化的DNA序列结合，即具有与目的基因组DNA序列三重结合的特异性；(3)将提取到的DNA样本按照EZ DNA Methylation‑Gold

【技术特征摘要】
1.一种用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取人基因组DNA样本，DNA浓度为500ng/μL，纯度介于1.8<DNA260/280<2.0之间；(2)设计合成一对特异性引物，该特异性引物既能够与没有经过甲基化试剂处理的基因组DNA序列结合，也能够与经过甲基化试剂处理后发生甲基化的基因组DNA序列、或者经过甲基化试剂处理而没有发生甲基化的DNA序列结合，即具有与目的基因组DNA序列三重结合的特异性；(3)将提取到的DNA样本按照EZDNAMethylation-GoldTMKit的说明书进行甲基化处理；(4)以步骤(3)中处理后的DNA样本为模板，采用步骤(2)合成的特异性引物，按照特定的PCR扩增体系与PCR反应条件进行PCR扩增，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，识别扩增产物，与预期片段大小一致；(5)将扩增后的PCR产物回收、纯化，进行DNA测序，将所得序列与已公开数据库序列进行比对，确定此DNA片段为Sipa1基因启动子区域，进而获取Sipa1基因甲基化信息。2.根据权利要求1所述的用于检测Sipa1基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：基因组DNA模板浓度为500ng/μL，体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏莉，卢昂，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42