本发明专利技术涉及一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的InDel分子标记，命名为InDel‑zym2，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗性基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。本发明专利技术的InDel分子标记具有高稳定性，可以简便、快速、高通量的应用于黄瓜苗期ZYMV抗性单株的辅助筛选；根据SEQ ID NO.5与SEQ ID No.6所示，由插入/缺失突变造成的抗性候选基因DNA长度的差异，还可以设计多对共显性的InDel标记作为ZYMV抗性筛选的分子标记。本发明专利技术的InDel标记为ZYMV抗性的分子标记辅助育种奠定了基础，这将大大加快黄瓜ZYMV抗性分子育种的进程。
【技术实现步骤摘要】
与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记
本专利技术涉及基因工程技术，尤其是涉及与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的InDel分子标记。
技术介绍
黄瓜(CucumissativusL.)为葫芦科(Cucurbitaceae)一年生草本蔓生攀缘植物。原产喜马拉雅山南麓的印度北部地区，我国已有2000多年的栽培历史，是黄瓜的次生起源中心。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一，其作为重要的蔬菜作物历来备受育种家的重视。近年，ZYMV(ZucchiniYellowMosaicVirus，黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒)对黄瓜危害愈发严重，黄瓜感染ZYMV后，叶片出现黄化、花叶，叶片表面有瘤状突起，发病严重时叶片皱缩、畸形，植株矮化，甚至死亡，影响了植株的生长发育，降低了黄瓜果实的产量与品质。ZYMV的防治主要是对其传播媒介的防治，植物一旦感染ZYMV，目前尚没有有效的药剂可以治理，因此，要从根本上解决这些问题，需要培育优质抗病黄瓜新品种，以满足种植者和消费者的需求。常规的抗性育种费时费力，需要经历多代回交和杂交的过程；病害发生需要专门的病圃进行接种鉴定，且受环境影响较大；黄瓜ZYMV抗性由一对隐性基因控制，回交育种过程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入；这些都增加了培育黄瓜抗病品种的难度。分子育种可以大大加速抗病育种进程，显著缩短育种周期。现代生物技术的迅猛发展，为抗病育种开辟了新的途径，利用生物技术培育抗病品种已成为目前的热点。分子育种的前提是获得相关性状的功能基因或与其紧密连锁的分子标记。利用分子标记分析体系，在遗传群体上鉴定抗病遗传规律，定位和克隆ZYMV抗性基因，研究其功能和抗性的分子调控机制，可以为黄瓜抗性基因的分子标记辅助育种及分子设计育种提供理论依据。利用与抗病基因紧密连锁或共分离的分子标记，开展分子标记辅助选择育种，可将多个抗病基因整合到一个品种，显著提高育种效率，缩短育种时间，而且大幅度提高了抗病的力度和持久性，这对于培育出满足种植者需求的黄瓜抗病新品种具有重要意义。ZYMV拥有较长的研究历史，1973年，Lisa等首次从西葫芦上分离并描述了ZYMV，可通过蚜虫进行非持久性传播，随后Provvidenti等人的研究表明，黄瓜的ZYMV抗性由一对隐性基因zym/zym控制。2013年，Amano等以感ZYMV黄瓜自交系‘CS-PMR1’和抗ZYMV黄瓜自交系‘A192-18’为亲本构建F2群体，将zymA192-18定位于黄瓜六号染色体50kb的区间内，其中包含六个候选基因，在亲本间对候选基因的分析结果表明，Vacuolarproteinsorting-associatedprotein4-like(VPS4-like)基因(Csa6M152960.1)为最有可能的候选基因，两个亲本间在该基因的第一外显子处存在两个碱基多态性，该基因可能与病毒的复制和在细胞间的移动相关。上述研究表明，黄瓜ZYMV抗性是单个隐性基因控制，目前已获得的某些连锁标记遗传距离较远或者不适用于大规模群体筛选，不利于分子标记辅助育种的开展。因此，寻找与黄瓜ZYMV抗性基因紧密连锁、共分离的分子标记，为其抗病分子育种提供良好的技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种基于黄瓜ZYMV抗性候选基因开发的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，此标记利用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以清晰地显示出差异，方便应用于ZYMV抗性分子辅助育种。本专利技术通过对ZYMV抗感黄瓜材料的抗性候选基因测序发现，在内含子区域发现抗病材料中的一个63bp的插入，利用此插入/缺失突变，我们开发了一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的InDel分子标记，以便分子标记辅助育种体系的建立。本专利技术的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，命名为InDel-zym2，由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列片段和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。所述InDel-zym2由SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物扩增得到。所述抗病基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述感病基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQIDNO.5所示序列，由候选基因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQIDNO.6所示序列；两者之间存在一个63bp的插入/缺失突变，根据此插入/缺失突变，可以设计多个诸如InDel-zym2与ZYMV抗性共分离的共显性InDel分子标记。上述SEQIDNO.1为InDel-zym2在抗病亲本扩增的序列，由119个核苷酸组成；SEQIDNO.2为InDel-zym2在感病亲本扩增的序列，由182个核苷酸组成。经过多个抗病、感病自交系的分子检测分析，抗病自交系均扩增出119bp大小的条带，而感病自交系均扩增出182bp大小的条带。通过回交分离群体分析，此标记与ZYMV抗性基因共分离。因此，此共显性的InDel标记有利于ZYMV抗性育种的分子标记辅助体系的建立，可简便、快速、高通量地应用于育种实践。上述上游引物和下游引物由上海华津生物科技有限公司合成，合成方法为常规生物学方法。传统的抗性育种费时费力，需要通过多代回交和杂交的过程。病害发生需要专门的病圃进行接种鉴定，且受环境影响较大。黄瓜ZYMV抗性由单一隐性基因控制，回交育种过程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入。这些因素都增加了ZYMV抗性育种的周期和难度。与现有技术相比，本专利技术的共分离InDel分子标记为共显性，能够区分纯合子和杂合子，在黄瓜苗期即可鉴定植株的基因型，省去了回交渗入过程中每代自交的步骤；此InDel标记条带差异大，用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳即可清晰地区分基因型，用它来跟踪抗性基因，既准确又省时省力，可用于黄瓜ZYMV抗性的分子标记辅助育种，加速黄瓜ZYMV抗性育种的进程。附图说明图1是分子标记InDel-zym2在不同的抗、感自交系的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果。抗病自交系都为119bp大小的条带，感病自交系都为182bp大小的条带。图2是分子标记InDel-zym2在回交分离群体的琼脂糖凝胶电泳效果。图中所示，SA0422为感病亲本，TMG-1为抗病亲本，F1代表杂交一代；R和S分别代表回交分离群体中随机挑选的抗病和感病植株的检测结果；M代表Marker。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例一、基于黄瓜ZYMV抗性候选基因的InDel标记的开发与鉴定1、多个抗、感自交系的验证由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQIDNO.5所示序列，由候选基因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQIDNO.6所示序列；两者之间存在一个63bp的插入/缺失突变，据此突变，本专利技术利用Primer5.0引物设计软件在突变的两侧设计正反向引物。上游引物为SEQIDNO.3所示，下游引物为SEQIDNO.4所示，抗性材料的扩增条带为119bp，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，命名为InDel‑zym2，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。
【技术特征摘要】
1.一个与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，命名为InDel-zym2，由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列片段和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。2.根据权利要求1所述的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，其特征在于，所述InDel-zym2由SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物扩增得到。3.根据权利要求1所述的与黄瓜ZYMV抗性基因共分离的新型InDel分子标记，其特征在于，所述抗病基因的核苷酸序列如SEQIDNO....
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡润，潘俊松，郭春立，孙敬贤，何欢乐，吕铎，杨义，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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