一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法技术

发明专利技术公开了一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术通过多次同源重组将黑曲霉维素酶系相关的基因大片段一次性整合到里氏木霉基因组中，具体为：将两段里氏木霉基因组片段、潮霉素抗性基因单元盒整合到黑曲霉基因组上，再以这两段片段为同源重组位点、潮霉素抗性为筛选标记将黑曲霉基因组上这两个位点之间的大片段整合到了里氏木霉基因组上，达到纤维素酶基因、非纤维素酶基因多克隆的效果，从而影响里氏木霉的代谢网络，提高里氏木霉的纤维素酶酶活。通过本发明专利技术方法得到的菌株的滤纸酶活是出发菌株的2.28倍。

【技术实现步骤摘要】
一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。
技术介绍
里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类；里氏木霉具有很好的胞外酶表达能力，是食品或工业生产中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶系的方法是通过基因工程的手段导入葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。目前这些方法中，每次只能剔除一个基因或增强一个基因的表达。实际上，非纤维素酶的酶类对里氏木霉的代谢网络也会产生影响。非纤维素酶类和纤维素酶类的多克隆可能是提高纤维素酶酶活的一个创新型的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，该方法通过多次同源重组将黑曲霉维素酶系相关的基因大片段一次性整合到里氏木霉基因组中，达到纤维素酶基因、非纤维素酶基因多克隆的效果，从而影响里氏木霉的代谢网络，提高里氏木霉的纤维素酶酶活。本专利技术的目的还在于提供一种纤维素酶酶活提高的里氏木霉菌株。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：（1）合成两端含有限制性内切酶酶切位点序列的如下DNA片段：DNA片段1：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段1-黑曲霉基因同源片段后段1-酶切位点序列2；DNA片段1-2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-里氏木霉基因组片段1-酶切位点序列2；DNA片段2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段2-黑曲霉基因同源片段后段2-酶切位点序列2。其中，黑曲霉基因同源片段前段1的序列如SEQIDNO.1所示，潮霉素抗性基因单元盒的序列如SEQIDNO.2所示，里氏木霉基因组片段1的序列如SEQIDNO.3所示，黑曲霉基因同源片段后段1的序列如SEQIDNO.4所示，黑曲霉基因同源片段前段2的序列如SEQIDNO.5所示，里氏木霉基因组片段2的序列如SEQIDNO.6所示，黑曲霉基因同源片段后段2的序列如SEQIDNO.7所示。（2）将步骤（1）中的3个DNA片段分别连接到载体上构建得到同源重组载体1、同源重组载体1-2、同源重组载体2。（3）用同源重组载体1转化黑曲霉，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1。黑曲霉菌株1的基因组上含有外源片段潮霉素抗性基因单元盒、里氏木霉基因组片段1。用同源重组载体1-2转化黑曲霉菌株1，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1-2。黑曲霉菌株1-2在黑曲霉菌株1的基础上去除了潮霉素抗性基因单元盒，其基因组上含有外源片段里氏木霉基因组片段1。用同源重组载体2转化黑曲霉菌株1-2，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株2。黑曲霉菌株2的基因组上含有外源片段里氏木霉基因组片段1、潮霉素抗性基因单元盒、里氏木霉基因组片段2。（4）将黑曲霉菌株2的基因组断裂片段导入到里氏木霉，以潮霉素抗性作为筛选标记，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株G，里氏木霉菌株G的纤维素酶酶活得到提高。此过程的同源重组是以里氏木霉基因组片段1、里氏木霉基因组片段2为同源重组位点，将黑曲霉菌株2基因组上这两个位点之间的大片段整合到了里氏木霉基因组上。优选的，上述方法中，所述的载体为pCAMBIA1300，酶切位点序列1、酶切位点序列2分别为SacII、HindIII的酶切位点序列；所述的黑曲霉为黑曲霉CBS513.88；所述的里氏木霉为里氏木霉QM6a。一种纤维素酶酶活提高的里氏木霉菌株，通过上述方法得到。本专利技术大大提高了里氏木霉的纤维素酶酶活，所得到菌株的滤纸酶活是出发菌株的2.28倍。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例11、材料黑曲霉CBS513.88，里氏木霉QM6a，质粒pCAMBIA1300（Biovector），农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶（TakaRA）等。合成的DNA片段1，其序列组成为：GGCCGCGG（SacII酶切位点序列）-黑曲霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段1-黑曲霉基因同源片段后段1-AAGCTTGG（HindIII酶切位点序列）。合成的DNA片段1-2，其序列组成为：GGCCGCGG（SacII酶切位点序列）-黑曲霉基因同源片段前段1-里氏木霉基因组片段1-AAGCTTGG（HindIII酶切位点序列）。合成的DNA片段2，其序列组成为：GGCCGCGG（SacII酶切位点序列）-黑曲霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段2-黑曲霉基因同源片段后段2-AAGCTTGG（HindIII酶切位点序列）。其中，黑曲霉基因同源片段前段1、潮霉素抗性基因单元盒、里氏木霉基因组片段1、黑曲霉基因同源片段后段1、黑曲霉基因同源片段前段2、里氏木霉基因组片段2、黑曲霉基因同源片段后段2的序列分别如SEQIDNO.1-7所示。2、方法一、同源重组质粒的构建（1）质粒pCAMBIA1300的提取含有pCAMBIA1300的大肠杆菌DH5α接种到含有卡那霉素的LB培养基（LB培养基：氯化钠1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃灭菌20min，加入微孔过滤的卡那霉素，卡那霉素在LB中的终浓度为30µg/mL）中，35℃培养过夜。使用质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照说明书说明提取pCAMBIA1300质粒，提取步骤如下：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2）取2mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm（13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm（13400×g）离心10min。6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）合成两端含有限制性内切酶酶切位点序列的如下DNA片段：DNA片段1：酶切位点序列1‑黑曲霉基因同源片段前段1‑潮霉素抗性基因单元盒‑里氏木霉基因组片段1‑黑曲霉基因同源片段后段1‑酶切位点序列2；DNA片段1‑2：酶切位点序列1‑黑曲霉基因同源片段前段1‑里氏木霉基因组片段1‑酶切位点序列2；DNA片段2：酶切位点序列1‑黑曲霉基因同源片段前段2‑潮霉素抗性基因单元盒‑里氏木霉基因组片段2‑黑曲霉基因同源片段后段2‑酶切位点序列2；其中，黑曲霉基因同源片段前段1的序列如SEQ ID NO.1所示，潮霉素抗性基因单元盒的序列如SEQ ID NO.2所示，里氏木霉基因组片段1的序列如SEQ ID NO.3所示，黑曲霉基因同源片段后段1的序列如SEQ ID NO.4所示，黑曲霉基因同源片段前段2的序列如SEQ ID NO.5所示，里氏木霉基因组片段2的序列如SEQ ID NO.6所示，黑曲霉基因同源片段后段2的序列如SEQ ID NO.7所示；（2）将步骤（1）中的3个DNA片段分别连接到载体上构建得到同源重组载体1、同源重组载体1‑2、同源重组载体2；（3）用同源重组载体1转化黑曲霉，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1；用同源重组载体1‑2转化黑曲霉菌株1，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1‑2；用同源重组载体2转化黑曲霉菌株1‑2，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株2；（4）将黑曲霉菌株2的基因组断裂片段导入到里氏木霉，以潮霉素抗性作为筛选标记，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株G，里氏木霉菌株G的纤维素酶酶活得到提高。...

【技术特征摘要】
1.一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）合成两端含有限制性内切酶酶切位点序列的如下DNA片段：DNA片段1：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段1-黑曲霉基因同源片段后段1-酶切位点序列2；DNA片段1-2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-里氏木霉基因组片段1-酶切位点序列2；DNA片段2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段2-黑曲霉基因同源片段后段2-酶切位点序列2；其中，黑曲霉基因同源片段前段1的序列如SEQIDNO.1所示，潮霉素抗性基因单元盒的序列如SEQIDNO.2所示，里氏木霉基因组片段1的序列如SEQIDNO.3所示，黑曲霉基因同源片段后段1的序列如SEQIDNO.4所示，黑曲霉基因同源片段前段2的序列如SEQIDNO.5所示，里氏木霉基因组片段2的序列如SEQIDNO.6所示，黑曲霉基因同源片段后段2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，曾徐浩，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42