一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法技术

本发明专利技术适用于生物质资源转化利用技术领域，提供一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，具体的，通过敲除里氏木霉的主要β‑葡萄糖苷酶基因，使得混菌发酵过程中，其主要利用生物质原料中的氮源合成纤维素酶，将生物质主要水解为自身难代谢的寡糖，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；产油酵母弯曲隐球酵母则在氮限制下，将水解所得的寡糖转运至胞内大量导向油脂合成。本方法实现非常简单，可以有效避免混菌发酵过程中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，实现生物质原料中碳/氮源的定向转化，显著提高油脂产量和得率，充分利用了生物质资源，从产油微生物菌体提取的微生物油脂可作为制备生物柴油和油脂化工产品的原料。

【技术实现步骤摘要】
一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法
本专利技术属于生物质转化利用
，尤其涉及一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，该方法能够显著提高混菌发酵转化生物质生产油脂产量和得率。
技术介绍
自然界中某些酵母菌、霉菌、细菌和藻类在特定条件下，能够以碳水化合物、碳氢化合物、二氧化碳等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内积累油脂并超过细胞干重20％w/w(这里w/w表示质量比，下同)的微生物称为产油微生物。微生物油脂，尤其是产油酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，可作为生物柴油的替代原料。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。利用生物质资源中的碳水化合物制备微生物油脂，作为生物柴油和功能性油脂的替代原料，是生物炼制的一个崭新研究方向。然而，基于生物质原料的复杂特性，当前产油酵母转化生物质原料制备油脂面临油脂产量低和工艺流程长的突出问题。诱导产油酵母油脂的过量积累通常需要营养限制，其中氮限制是当前诱导油脂过量积累最有效的策略。生物质原料来源广泛，利用其培养产油酵母，有可能大幅度降低原料成本，并使规模化制备微生物油脂的原材料得到保障。然而，生物质原料，尤其是草本生物质和农业废弃生物质，除可提供碳水化合物外，还富含微生物生长繁殖必需的其它营养组分，其中较高的氮含量，特别不利于诱发微生物过量积累油脂，导致油脂产量和油脂得率较低。研究发现，只要实现低氮营养胁迫，产油酵母就能够高效地积累油脂。因此，过量氮源的移除是将生物质高效转化为微生物油脂的关键。采用化学或生物的方法，部分脱除生物质原料中的氮、磷等组分，实现营养胁迫，可诱发油脂的过量积累。然而，这些策略增加了操作工艺，并导致碳水化合物的损失，经济性很差。另外，当前利用生物质原料制备微生物油脂还存在着工艺流程长的突出问题。统合生物加工(Consolidatedbioprocessing,CBP)是指将纤维素酶的生产、酶水解、己糖和戊糖油脂发酵进行高度整合，由同一株菌完成的技术。由于产油酵母本身并不具备纤维素酶的生产能力，采用重组策略获得的产油酵母工程菌产酶性能一般，当前尚未见产油酵母采用CBP技术直接转化生物质高效制备微生物油脂的报道。一种非常有潜力的替代方案是混菌发酵，即采用高产纤维素酶的霉菌和高产油脂的产油酵母共培养的方式，可实现生物质原料的“一锅法”制备微生物油脂。理想状态下，前者利用生物质中不利于微生物激发油脂积累的过量氮源的合成纤维素酶，水解生物质为后者提供足够的碳源，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；而后者则主要在氮源营养胁迫下，将水解所得的碳水化合物导向油脂合成。然而，当前混菌发酵技术仍然存在着纤维素酶生产、微生物生长及油脂积累不协调的突出问题；霉菌消耗过多的营养成分，尤其是碳源，导致用于合成油脂的碳源显著减少，油脂产量低下。因此，混菌发酵时，实现生物质原料中碳、氮源转化的定向调控，是强化油脂生产的关键。为了更高效的利用生物质资源，需要开发一种简单的调控方法，实现生物质原料中碳、氮源的定向转化，解决混菌发酵过程中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，显著提高油脂产量和得率，对混菌发酵技术高效制备微生物油脂具有重要意义。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术的目的在于提供一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，旨在解决当前混菌发酵过程中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，本方法能够显著提高油脂产量和得率。本专利技术提出一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，具体包括如下步骤：预处理生物质原料，调整固液质量比至5％-20％，不添加或者少量添加营养成分，调节pH至4.0-6.0，高温湿热灭菌，制备混菌发酵培养基；将里氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶基因敲除，获得里氏木霉工程菌；挑取里氏木霉工程菌和产油酵母，分别接种于对应的液体种子培养基中，得到工程菌种子液和产油酵母种子液；将两种种子液接种至所述混菌发酵养基中，于25℃-37℃通气培养，直至培养基中碳水化合物及其聚合物浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物；沉淀物采用酸热-有机溶剂法提取油脂。本专利技术的有益效果是：里氏木霉是一株高产纤维素酶的菌株，其纤维素酶系具有很高的外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶活力，而β-葡萄糖苷酶活性极低，可将纤维素不完全水解为纤维寡糖；产油酵母如弯曲隐球酵母则具有高效的寡糖转运系统和很高的胞内β-葡萄糖苷酶活性，能高效转运和代谢纤维寡糖并大量积累油脂；本专利技术首先敲除里氏木霉的关键β-葡萄糖苷酶基因，然后将里氏木霉工程菌和弯曲隐球酵母混合培养，根据重组里氏木霉和弯曲隐球酵母酶谱互补性和寡糖代谢能力的差异，使得混菌发酵时，前者主要利用生物质原料中的过量氮源营养合成纤维素酶，水解生物质为自身难代谢的寡糖，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；而后者则主要在氮源营养胁迫下，将水解所得的寡糖主要导向油脂合成，最终实现生物质原料中碳、氮流的定向自调控，显著提高油脂产量和得率。另外，本专利技术采用混菌发酵，将纤维素酶的生产、酶水解和油脂发酵高度整合，实现了生物质“一锅法”转化高效制备微生物油脂。综上所述，本专利技术为生物质经济、高效转化制备酵母油脂提供新的方法。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术通过合理选择产纤维素酶的菌株和产油酵母菌株，并对产纤维素酶菌株的酶谱进行改造，使得混菌培养时，前者的主要目的是利用生物质原料中过量的氮源营养合成纤维素酶，水解生物质为自身难代谢的寡糖，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；而后者则主要在氮源营养胁迫下，将水解所得的寡糖转运至胞内主要导向油脂合成，最终显著提高混菌发酵生产油脂的产量和得率。方法极其简单，避免了当前混菌发酵技术中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，显著提高油脂产量和得率，具有明显的技术优势。本专利技术方法具体包括如下步骤：步骤S101、预处理生物质原料，调整固液质量比至5％-20％，不添加或者少量添加营养成分，调节pH至4.0-6.0，高温湿热灭菌，制备混菌发酵培养基。本步骤所采用的预处理方法为常用的物理、化学、物理化学或生物的生物质预处理方法。本步骤不添加或添加少量的营养成分，包括磷源、硫源和维生素，如硫酸盐、磷酸盐、硫胺素等或它们的组合，其中磷源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-2％、硫源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-1％、维生素占混菌发酵培养基总质量的0.001％以内。本步骤所适用的生物质原料为主要成份为纤维素、半纤维素、木质素和粗蛋白的生物质材料。包括玉米秸秆、玉米芯、稻草、稻壳和麦秆等农业生物质，水葫芦、浮萍和稗子等杂草，柳枝稷和芒草等能源植物中的一种或二种以上组合。步骤S102、于无菌操作环境中，挑取里氏木霉工程菌和产油酵母，分别接种于各自液体种子培养基中培养，作为一种优选实施方式，于25℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：预处理生物质原料，调整固液质量比至5％‑20％，不添加或者少量添加营养成分，调节pH至4.0‑6.0，高温湿热灭菌，制备混菌发酵培养基；将里氏木霉主要的β‑葡萄糖苷酶基因敲除，获得里氏木霉工程菌；挑取里氏木霉工程菌和产油酵母，分别接种于对应的液体种子培养基中，得到工程菌种子液和产油酵母种子液；将两种种子液接种至所述混菌发酵养基中，于25℃‑37℃通气培养，直至培养基中碳水化合物及其聚合物浓度之和低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物；沉淀物采用酸热‑有机溶剂法提取油脂。

【技术特征摘要】
1.一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：预处理生物质原料，调整固液质量比至5％-20％，不添加或者少量添加营养成分，调节pH至4.0-6.0，高温湿热灭菌，制备混菌发酵培养基；将里氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶基因敲除，获得里氏木霉工程菌；挑取里氏木霉工程菌和产油酵母，分别接种于对应的液体种子培养基中，得到工程菌种子液和产油酵母种子液；将两种种子液接种至所述混菌发酵养基中，于25℃-37℃通气培养，直至培养基中碳水化合物及其聚合物浓度之和低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物；沉淀物采用酸热-有机溶剂法提取油脂。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述预处理方法为物理、化学、物理化学或生物的生物质预处理方法。3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述混菌发酵培养基中不添加或者少量添加营养成分，包括磷源、硫源和维生素，其中磷源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-2％、硫源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-1％、维生素占混菌发酵培养基总质量的0.001％以内。4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物质原料为主要成份为纤维素、...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚志伟，赵觅，高芳，颜家保，周文婷，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42