一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法技术

本发明专利技术公开了一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：（1）构建以启动子序列‑信号肽编码序列‑葡糖苷酶编码序列‑终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒。表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同。（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上。（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。本发明专利技术利用不同的信号肽进行组合，避免相同信号肽竞争，从而提高了里氏木霉所产纤维素酶的酶活。

【技术实现步骤摘要】
一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。
技术介绍
里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类，里氏木霉具有胞外表达酶量大等优点，是工业生产酶制剂中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，纤维素葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法是通过基因工程的手段导入纤维素葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。一些多克隆研究中，有些通过多克隆的基因表达量增加的不多，或者是三拷贝的基因克隆与二拷贝的基因克隆相比，目标基因表达量几乎没有大的提升。已有的多克隆增加基因表达量的方法采用的都是相同的信号肽，信号肽对胞外酶的分泌具有重要的影响。信号肽与其连接的蛋白构成一个分泌的蛋白整体，这个蛋白整体的电荷分布、分子量大小、蛋白的形状等都影响到分泌的效率。相同信号肽连接的蛋白在外分泌的过程中可能有分泌竞争存在，这样即使是二克隆或三克隆表达的蛋白不能迅速分泌向胞外。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，以及通过该方法得到的里氏木霉菌株。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：（1）构建以启动子序列-信号肽编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒。表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同；相邻两个单元之间优选通过连接序列连接。（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上。（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。步骤（1）中所述的葡糖苷酶多拷贝表达盒的组成优选为：启动子序列-信号肽1编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽2编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽3编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列。所述的启动子序列、信号肽1编码序列、葡糖苷酶编码序列、终止子序列、连接序列、信号肽2编码序列、信号肽3编码序列分别优选如SEQIDNO.1-7所示。步骤（2）中所述的表达载体优选为pCAMBIA1300；所述的限制性内切酶优选为EcoRI和PmeI。步骤（3）优选通过农杆菌将构建的重组载体转化到里氏木霉中。步骤（3）中所述的里氏木霉优选为里氏木霉ATCC24449。一种里氏木霉菌株，为上述转化有重组载体的里氏木霉菌株。本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术利用不同的信号肽进行组合，避免相同信号肽竞争，从而提高了里氏木霉所产纤维素酶的酶活。具体实施方式实施例11、材料里氏木霉ATCC24449，质粒pCAMBIA1300（Biovector），农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶（TakaRA）等。合成的两段有酶切位点的多拷贝表达片段1。多拷贝表达片段1的序列组成为：CCGAATTC（EcoRI酶切位点序列）-启动子序列-信号肽1编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-终止子与启动子之间的连接序列（连接序列）-启动子序列-信号肽2编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽3编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-GTTTAAACGG（PmeI酶切位点序列）。其中，启动子序列如SEQIDNO.1所示，信号肽1编码序列如SEQIDNO.2所示，葡糖苷酶编码序列如SEQIDNO.3所示，终止子序列如SEQIDNO.4所示，连接序列SEQIDNO.5所示，信号肽2编码序列如SEQIDNO.6所示，信号肽3编码序列如SEQIDNO.7所示。2、方法一、重组质粒的构建（1）质粒pCAMBIA1300的提取含有pCAMBIA1300的大肠杆菌DH5α接种到含有卡那霉素的LB培养基（LB培养基：氯化钠1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃灭菌20min，加入微孔过滤的卡那霉素，卡那霉素在LB中的终浓度为30µg/mL）中，35℃培养过夜。使用质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照说明书说明提取pCAMBIA1300质粒，提取步骤如下：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2）取2mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm（13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm（13400×g）离心10min。6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9）重复操作步骤8）。10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。（2）质粒pCAMBIA1300、多拷贝表达片段1的酶切和电泳往41μLpCAMBIA1300质粒溶液或多拷贝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）构建以启动子序列‑信号肽编码序列‑葡糖苷酶编码序列‑终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒；表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同；（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上；（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。

【技术特征摘要】
1.一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）构建以启动子序列-信号肽编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒；表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同；（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上；（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的葡糖苷酶多拷贝表达盒中相邻两个单元之间通过连接序列连接。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的葡糖苷酶多拷贝表达盒的组成为：启动子序列-信号肽1编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽2编码序列-葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，曾徐浩，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42