一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用，包括如下步骤：(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增KS基因的上游片段UKS和下游片段DKS；(2)将上游片段UKS和下游片段DKS与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；(3)将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。本发明专利技术提供了裂殖壶菌敲除基因的工程菌的构建方法构，建了敲除FabA基因裂殖壶菌重组菌，该工程菌产多不饱和脂肪酸的能力比出发菌株中所占总油脂的比例减少了43％，而16碳和18碳饱和脂肪酸的生产量增加29％。

Construction method of engineering bacteria for breaking gene of ketone synthetase gene knockout and application thereof

The invention discloses a construction method and application in Schizochytrium engineering bacteria on a ketone synthase gene, which comprises the following steps: (1) to Schizochytrium genomic DNA template, using upstream primer and downstream primer pairs of UKS upstream fragment were amplified by PCR KS gene and downstream fragment DKS; (2) the upstream fragment UKS and downstream fragment DKS and knockout plasmid to construct the recombinant knockout plasmid; (3) the recombinant knockout plasmid transformation Schizochytrium, screened by resistance plate, and the PCR resistance gene sequence was verified transformants, namely ketosynthases gene the knockout of Schizochytrium engineering bacteria. The present invention provides a method for constructing Schizochytrium knock structure except gene, constructed FabA gene knockout Schizochytrium recombinant bacteria, the bacteria producing polyunsaturated fatty acids than starting strain in total fat reduction in the proportion of 43%, 16 and 18 carbon saturated fatty acid production increased by 29%.

【技术实现步骤摘要】
一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及其应用。
技术介绍
多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，PUFAs)，指一类18-22碳，包含两个或两个以上不饱和双键的直链脂肪酸，在生物细胞中发挥重要作用，例如，作为细胞膜重要组分，储存油脂，信号传导等功能。目前，PUFAs被分为n-6(或ω-6)和n-3(或ω-3)族两类。在这两类脂肪酸中，n-3族多不饱和脂肪酸包括亚麻酸(α-Linolenicacid，ALA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(DocosahexaenoicAcid，DHA)，n-6族多不饱和脂肪酸以花生四烯酸(Arachidonicacid，ARA)和亚麻油酸(Gamma-LinolenicAcid，GLA)为主。多不饱和脂肪酸，尤其是n-3族，作为生物活性物质，是促进人类健康和动物生长必要营养物质。裂殖壶菌是多不饱和脂肪酸的重要生产菌株，目前已被工业化生产DHA，其细胞油脂含量高，生长繁殖快，更耐受机械搅拌，适宜发酵罐大规模培养，并已被美国及欧洲有关食品权利机构批准添加至相关食物中使用(Regulation(EC)No258/97ofEuropeanParliament，2010)。已经证明，裂殖壶菌具有PUFA合成酶途径(类PKS途径)大量合成多不饱和脂肪酸的能力(Science，2001，293(5528)：290-293；生物工程学报，2010，26(9)：1225-1231；Progressinlipidresearch，2014，56：19-35)，但是其PKS基因簇合成和调控多不饱和脂肪酸的机理仍然未有明确解释。羟基脂酰基ACP酮基合成酶(beta-hydroxydecanoyl-acylcarrierprotein(ACP)-dehydratase，FabA)在植物、动物和微生物中广泛分布，与不饱和脂肪酸合成代谢密切相关的酶。FabA基因编码有双功能的3-羟基脂酰ACP脱水异构酶，其异构产物能被FabB基因编码的3-酮基脂酰ACP合成酶I延伸，合成不饱和脂肪酸。该途径被认为是缺氧条件下不饱和脂肪酸合成的经典途径。该脱氢酶基因是多不饱和脂肪酸合成的关键基因之一，裂殖壶菌的PKS基因簇中包含多个脱氢酶(FabA)序列，FabA基因参与了多不饱和脂肪酸合成过程，然而其作用机制目前仍然不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法。本专利技术的另一目的在于提供上述构建的裂殖壶菌工程菌的应用。本专利技术的技术方案如下：一种酮基合成酶(Beta-ketoacylsynthase，KS)基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增KS基因的上游片段UKS和下游片段DKS，上述上游引物对包括上游正向引物和上游反向引物，分别如SEQIDNO01和SEQIDNO02所示，下游引物对包括下游正向引物和下游反向引物，分别如SEQIDNO03和SEQIDNO04所示；(2)将上游片段UKS和下游片段DKS与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；(3)将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。KS基因是编码酮基合成酶的基因，可以催化乙酰基辅酶A聚酮合成酮基脂酰ACP，是合成多不饱和脂肪酸的重要步骤，裂殖壶菌PKS基因簇中OrfB片段包含两个KS基因，参与多不饱和脂肪酸的合成。基于以上理论分析，通过在裂殖壶菌中敲除OrfB中第二个KS基因，能够使其功能被屏障，并可以进一步的对生物体造成影响，进而推测出该基因在裂殖壶菌合成PUFAs过程中的作用，为探究裂殖壶菌中多不饱和脂肪酸合成的机理提供重要帮助。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述敲除载体为pBlu-Zeo。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的程序包括如下：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s；(4)72℃，1min；(5)重复(2)～(4)35个循环；(6)72℃，10min；(7)4℃保存。本专利技术的另一技术方案如下：一种多不饱和脂肪酸的生产方法，用权利要求1至3中任一权利要求所述构建方法构建的裂殖壶菌工程菌进行发酵生产。在本专利技术的一个优选实施方案中，包括如下步骤：(1)将所述裂殖壶菌工程菌接种于液体种子培养基中培养，获得种子培养液；(2)将步骤(1)所得的种子培养液接种于发酵培养基中培养，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液；(3)将步骤(3)所得的发酵液中的菌体充分消化，加入正己烷混匀后静置分层，获得有机相，接着用正己烷清洗该有机相至无色，最后去除正己烷，即得所述多不饱和脂肪酸。进一步优选的，所述步骤(1)为：将所述裂殖壶菌工程菌接种于液体种子培养基中，于27～29℃，180～220rpm培养24～48h，获得种子培养液。进一步优选的，所述步骤(2)为：将步骤(1)所得的种子培养液以3～5％的体积比接种于发酵培养基中，于27～29℃，180～220rpm培养4～6d，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了裂殖壶菌敲除基因的工程菌的构建方法构，建了敲除FabA基因裂殖壶菌重组菌，该工程菌产多不饱和脂肪酸的能力比出发菌株中所占总油脂的比例减少了43％，而16碳和18碳饱和脂肪酸的生产量增加29％，表明了酮基合成酶KS在不饱和脂肪酸合成中有着重要的作用，而其敲除却并未影响饱和脂肪酸的合成。附图说明图1为本专利技术实施例1中基因敲除重组菌株SchΔKS的基因组博莱霉素抗性片段PCR验证结果图，其中泳道1为SchΔKS博莱霉素抗性片段，泳道2为阴性对照。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1：敲除重组载体质粒pBlu-UKS-Zeo-DKS的构建设计PCR引物，用于扩增KS基因上游片段UKS。正反向引物分别为：正向引物1：GGGGTACCCCCACATCCTACATCGGCAACC(SEQIDNO01)反向引物2：GCGTCCATGCAGGCGTAAGGTAGCTACC(SEQIDNO02)设计PCR引物，用于扩增KS基因下游片段DKS。正反向引物分别为：正向引物3：CGGGATCCCGCTGCCTAAGGAACTCACTGCT(SEQIDNO03)反向引物4：CGAAATGCGGCTCTTGGTCTGCTCGAGC(SEQIDNO04)以SchizochytriumlimacinumATCC1381基因组DNA为模板，进行如下PCR程序：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s(4)72℃，1min，(2)-(4)步重复35个循环；(5)72℃，10min，4℃保存。PCR反应体系如下表：将敲除载体pBlu-Zeo(参见公开文献：Themetabolicburdenofcellulaseexpressionb本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增KS基因的上游片段UKS和下游片段DKS，上述上游引物对包括上游正向引物和上游反向引物，分别如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示，下游引物对包括下游正向引物和下游反向引物，分别如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示；(2)将上游片段UKS和下游片段DKS与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；(3)将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增KS基因的上游片段UKS和下游片段DKS，上述上游引物对包括上游正向引物和上游反向引物，分别如SEQIDNO01和SEQIDNO02所示，下游引物对包括下游正向引物和下游反向引物，分别如SEQIDNO03和SEQIDNO04所示；(2)将上游片段UKS和下游片段DKS与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；(3)将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述敲除载体为pBlu-Zeo。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的程序包括如下：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s；(4)72℃，1min；(5)重复(2)～(4)35个循环；(6)72℃，10min；(7...

【专利技术属性】
技术研发人员：何宁，李志朋，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35