【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及合成生物学，具体涉及一种地衣芽孢杆菌工程菌及其在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。
技术介绍
1、γ-聚谷氨酸(γ-pga)是由微生物合成的一种胞外聚合物。它由谷氨酸单体通过γ-谷氨酰胺键聚合而成的一类均聚氨基酸，具有吸水性强、可降解、生物相容性强、无毒等优良特性，在工业、食品、医药、环境、农业、日化等行业都具有广阔的应用前景。γ-pga的分子量是影响其在不同应用中的性能的一个重要因素之一。在不同的实际应用中，需要γ-pga的分子量也不相同，例如在医药行业，需要的是低分子量γ-pga。微生物发酵所得的γ-pga的分子量通常大于1000kda，不同的用途需要γ-pga的分子量也不同。因此控制γ-聚谷氨酸的分子量显得十分重要。
2、相关技术中如中国专利技术专利申请cn 112175982 a通过构建了聚谷氨酸的外源合成途径，实现理性控制γ-pga分子量的目的，其将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ-pga合成酶的基因簇capbca克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌f343中进行外源表达，在此基础上，利用不同强度的rbs调控元件调控合成酶基因簇各基因的表达水平获得的重组菌株所生产的γ-pga分子量为295.47～28018kda。中国专利技术专利申请cn 108624546 a针对解淀粉芽孢杆菌，通过异源表达不同来源的γ-pga降解酶基因，控制诱导型启动子获取不同分子量范围的小分子γ-pga。其聚谷氨酸降解酶的表达通过控制诱导剂的浓度、诱导时间控制聚谷氨酸降解酶的表达量，来获取分子量为20～16000kda的小分子聚
3、然而，上述的相关研究是以外源基因自带表达原件而非自身基因组中的表达原件，这使得载体构建复杂，不易操作。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供一种地衣芽孢杆菌工程菌及其在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。本申请选以地衣芽孢杆菌b.licheniformis cgmcc 2876为底盘菌株，通过不同强度的内源性启动子的调控策略，进而调控γ-pga的分子量。
2、本专利技术的实施例提出了一种地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其包括以下步骤：
3、(1)以b.licheniformis cgmcc 2876基因组dna为模板扩增内源性启动子，并与rbs序列和绿色荧光报告蛋白gfp序列进行soe-pcr重叠串联，获得融合片段ppromter-rbs-gfp；
4、(2)将所述融合片段ppromter-rbs-gfp与线性的phy300plk-pamyl-tttamyl表达载体连接，获得内源性启动子报告工程载体phy-ppromoter-gfp；
5、(3)将所述内源性启动子报告工程载体phy-ppromoter-gfp转化地衣芽孢杆菌b.liche niformis cgmcc 2876中，获得地衣芽孢杆菌内源性启动子的报告工程菌株bl/pppromoter-gfp；
6、(4)将地衣芽孢杆菌内源性启动子的报告工程菌株bl/p ppromoter-gfp中的gfp基因替换为γ-pga降解酶基因pgds，获得地衣芽孢杆菌工程菌bl/pppromoter-pgds。
7、根据本专利技术实施例的一种地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，该方法利用筛选得到的不同表达强度的地衣芽孢杆菌内源性启动子，调控γ-聚谷氨酸的分子量，根据表达强度可以分为强、中、弱三种表达强度，其中内源性启动子p2967较强表达强度，使得γ-pga的分子量最低下降至1.61×103kda，并且提高了γ-pga的产量，证明地衣芽孢杆菌内源性启动子的调控策略对于为产生不同分子量的γ-聚谷氨酸可行且有效的，为产生不同分子量的γ-pga提供了新路径。
8、可选地，步骤(4)为：
9、以b.licheniformis cgmcc 2876基因组dna为模板进行扩增，并与rbs序列和γ-pga降解酶pgds序列进行soe-pcr重叠串联，获得融合片段ppromter-rbs-pgds；
10、将所述融合片段ppromter-rbs-gfp与线性的phy300plk-pamyl-tttamyl表达载体连接，获得地衣芽孢杆菌分子量工程载体phy-ppromoter-pgds；
11、将所述地衣芽孢杆菌分子量工程载体phy-ppromoter-pgds转化到地衣芽孢杆菌b.licheniformis cgmcc 2876中，获得地衣芽孢杆菌工程菌bl/pppromoter-pgds。
12、根据本专利技术的实施例，还提出了上述的构建方法构建出的地衣芽孢杆菌工程菌在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。
13、根据本专利技术的实施例，利用上述工程菌bl/pp2967-pgds可降低γ-pga平均分子量，例如在工程菌bl/pp2967-pgds中γ-pga平均分子量从1.25×105kda下降至1.61×103kda，γ-pga的产量提高了16.54％。
14、可选地，将所述地衣芽孢杆菌工程菌bl/pppromoter-pgds接种至培养基中，温度37℃、转速200rpm的条件下培养56h，取56h发酵液测定所产γ-pga的产量及平均分子量。
15、进一步地，将所述地衣芽孢杆菌工程菌bl/pppromoter-pgds接种至ph为7.2新鲜的种子培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养16～18h，获得种子菌液；将所述种子菌液以2％的接种量接种至ph为7.2新鲜的发酵培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养56h。
16、进一步地，所述种子培养基的配方包括：10g/l葡萄糖、0.5g/l尿素、0.5g/l酵母膏、0.1g/l kh2po4、0.1g/l k2hpo4、0.1g/l nacl和0.2g/l mgso4·7h2o。
17、进一步地，所述发酵培养基的配方包括：13.9g/l葡萄糖、2.67g/l尿素、0.6g/l酵母、5.6g/l kh2po4、1.4g/l k2hpo4、2g/l nacl和0.048g/l mgso4·7h2o。
18、本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
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1.一种地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)为：
3.如权利要求1或2所述的构建方法构建出的地衣芽孢杆菌工程菌在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS接种至培养基中，温度37℃、转速200rpm的条件下培养56h，取56h发酵液测定所产γ-PGA的产量及平均分子量。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS接种至pH为7.2新鲜的种子培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养16～18h，获得种子菌液；将所述种子菌液以2％的接种量接种至pH为7.2新鲜的发酵培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养56h。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述种子培养基的配方包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L尿素、0.5g/L酵母膏、0.1g/L KH2PO4、0.1g/L K2H
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方包括：13.9g/L葡萄糖、2.67g/L尿素、0.6g/L酵母、5.6g/L KH2PO4、1.4g/L K2HPO4、2g/L NaCl和0.048g/LMgSO4·7H2O。
...【技术特征摘要】
1.一种地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)为：
3.如权利要求1或2所述的构建方法构建出的地衣芽孢杆菌工程菌在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述地衣芽孢杆菌工程菌bl/pppromoter-pgds接种至培养基中，温度37℃、转速200rpm的条件下培养56h，取56h发酵液测定所产γ-pga的产量及平均分子量。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述地衣芽孢杆菌工程菌bl/pppromoter-pgds接种至ph为7.2新鲜的种子培养基中，于温度37℃转速200rpm的...
【专利技术属性】
技术研发人员：何宁，魏晓宇，夏文昊，陈泳斌，杨立杰，曹名锋，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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