本发明专利技术提供了一种N‑氨甲酰水解酶表达基因及其工程菌的构建。该N‑氨甲酰水解酶的制备方法，包括以下步骤：(1)目的菌的筛选；(2)细菌总DNA提取；(3)扩增该细菌总DNA，以获得N‑氨甲酰水解酶基因；(4)连接该N‑氨甲酰水解酶基因的DNA片段与表达载体，从而获得N‑氨甲酰水解酶的重组质粒；(5)将该的N‑氨甲酰水解酶基因的重组质粒转入到表达宿主中，发酵培养。该N‑氨甲酰水解酶基因编码的氨基酸序列在以N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸作为底物时表现出较高的酶活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种N-氨甲酰水解酶表达基因及其工程菌的构建，尤其涉及一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶表达基因及其工程菌的构建。
技术介绍
D-氨基酸及其衍生物是医药及食品领域的重要原材料，被广泛地用于合成半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊酯、杀虫剂和甜味剂。其中，D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)是生产半合成青霉素和半合成头孢菌素的主要侧链，被广泛应用于合成半合成广谱抗生素阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮、头孢罗奇有头孢羟胺唑等。D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)的合成方法有化学拆分和酶法拆分两类。由于化学法存在成本较高，污染严重等问题，因而酶法拆分日益受到重视。酶法拆分的基本原理是利用含有二氢嘧啶酶的微生物细胞定向转化D-对羟基苯海因(D-p-HPH)为D-氨甲酰对羟基苯甘氨酸(D-N-Carbamyl-p-HPG)；再利用含有氨甲酰水解酶的微生物细胞将其水解为D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)。在反应条件下，L-对羟基苯海因自发消旋为D-对羟基苯海因，达到D,L-对羟基苯海因的完全转化。自上世纪八十年代以来，酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究和应用得到发展，其过程如下：首先利用化学手段合成D，L-对羟基苯海因(D，L-HPH)作为生物酶作用的底物，然后利用生物酶将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲缩合得到D，L-对羟基苯乙内酰苯海因(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)立体专一性水解开环生成D-N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在碱性条件或者存在消旋酶的条件下，未被开环的L-型对映体消旋化为D-型从而进一步被转化。通过这种酶促不对称水解反应，可使混消旋的PHPH完全转化为D-HPG。现在，在工业上已有采用固定化的D-海因酶或固定化细胞进行该反应的报道。酶法生产D-对羟基苯甘氨酸在工业上有重要的应用价值，因此对其生产所用的相关酶的研究和改造有重要意义。D-海因酶可催化5’单替代海因或二氢尿嘧啶的开环，形成氨基甲酰类的中间物，该中间产物可被氨甲酰水解酶降解为D-对羟基苯甘氨基酸，成为半合成内酰胺类抗生素的重要中间体。因而，对海因酶的研究逐渐成为了相关行业的热点研究课题之一。目前，酶法拆分的主要问题在于所使用的微生物细胞所含氨甲酰水解酶的活力偏低，半衰期过短，导致中间产物水解时间过长，转化率偏低。
技术实现思路
本专利技术的主要优势在于提供一种新的N-氨甲酰水解酶基因及其表达的氨基酸序列；本专利技术的另一优势在于提供一种新的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶基因及其表达的氨基酸序列；本专利技术的另一优势在于提供一种来源于Streptomycessp.7-145(保藏编号CGMCCNO.7914)的新的N-氨甲酰水解酶基因；本专利技术的另一优势在于提供一种新的氨基酸，其由所述新的N-氨甲酰水解酶基因编码；本专利技术的另一优势在于提供一种新的N-氨甲酰水解酶的基因序列；本专利技术的另一优势在于提供一种载体DNA序列的新的重组质粒；本专利技术的另一优势在于提供一种新的N-氨甲酰水解酶的应用。通过下面的描述，本专利技术的其它优势和特征将会变得显而易见，并可以通过权利要求书中特别指出的手段和组合得到实现。为实现本专利技术的前述以及其它目的和优势，本专利技术提供一种N-氨甲酰水解酶基因，其中所述水解酶基因的DNA序列为SEQIDNo：1所示的DNA序列，其中所述水解酶基因来源于Streptomycessp.7-145(保藏编号CGMCCNO.7914)。优选地，所述水解酶基因编码的氨基酸序列为SEQIDNo：2所示的氨基酸序列。优选地，所述重组质粒具有SEQIDNo：2所述氨基酸序列的N-氨甲酰水解酶基因和一种载体DNA序列，其中所述N-氨甲酰水解酶基因具有SEQIDNo：1所示的DNA序列。优选地，所述载体为pET-21(b)、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980中的一种或两种以上的组合。优选地，所述载体为pET-28(a)。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一种N-氨甲酰水解酶制备方法，包括以下步骤：(1)目的菌的筛选；(2)链霉菌总DNA提取；(3)扩增所述链霉菌总DNA，以获得N-氨甲酰水解酶基因；(4)连接所述N-氨甲酰水解酶基因的DNA片段与表达载体，从而获得N-氨甲酰水解酶的重组质粒；(5)将所述的N-氨甲酰水解酶基因的重组质粒转入到表达宿主中，发酵培养。优选地，步骤(3)中所述链霉菌总DNA是通过PCR方法从Streptomycessp.7-145基因组扩增。优选地，步骤(4)中所述表达载体为pET-21(b)、pET28a、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980中的一种。优选地，步骤(5)中所述表达宿主为E.coliBL21、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌(WB600)中的一种。优选地，步骤(2)包括从Streptomycessp.7-145中提取链霉菌总DNA。本专利技术提供的N-氨甲酰水解酶基因编码的氨基酸序列不同于目前已知来源的N-氨甲酰水解酶，其在以N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸作为底物时表现出较高的酶活性。通过对随后的描述和附图的理解，本专利技术进一步的优势和优势将得以充分体现。本专利技术的这些和其它优势、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现。附图说明图1是D-对羟基苯甘氨酸的合成示意图。图2是N-氨甲酰水解酶表达载体PETJ2的构建示意图。图3A是目的蛋白电泳图。图3B是目的基因片段电泳图。图4是利用HPLC检测N-氨甲酰水解酶反应生成产物的曲线图。生物材料保藏说明生物材料的分类命名：链霉菌7-145拉丁文学名：Streptomycessp.7-145保藏日期：2013年7月12日保藏该生物材料样品的保藏单位全称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC)保藏编号：CGMCCNO.7914具体实施方式下述描述被揭露以使本领域技术人员可制造和使用本专利技术。下述描述中提供的较佳实施例仅作为对本领域技术人员显而易见的示例和修改，其并不构成对本专利技术范围的限制。下述描述中所定义的一般原理可不背离本专利技术精神和专利技术范围地应用于其它实施例、可选替代、修改、等同实施和应用。依据本专利技术的一第一优选实施方式的N-氨甲酰水解酶的含有优势基因的表达载体和工程菌的构建如下：1.实验准备1.1分离培养基的制备1号分离培养基的制备：将75ml0.4MHCl溶2g几丁质，5℃下搅拌12h，用2M氢氧化钠调pH至5.0，而后加去离子水至200ml，灭菌备用，得到A；B，K2HPO42.0g，KCl0.5g，KH2PO41.0g，CaCl20.1g，MgSO40.7g，Yeastextract0.5g，NaC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种N‑氨甲酰水解酶基因，其特征在于，所述水解酶基因的DNA序列为SEQ ID No：1所示的DNA序列，其中所述水解酶基因来源于链霉菌(Streptomyces sp.)7‑145。
【技术特征摘要】
1.一种N-氨甲酰水解酶基因，其特征在于，所述水解酶基因的DNA序列为SEQIDNo：1所示的DNA序列，其中所述水解酶基因来源于链霉菌(Streptomycessp.)7-145。2.根据权利要求1所述的水解酶基因，其特征在于，所述水解酶基因编码的氨基酸序列为SEQIDNo：2所示的氨基酸序列。3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒具有SEQIDNo：2所述氨基酸序列的N-氨甲酰水解酶基因和一种载体DNA序列，其中所述N-氨甲酰水解酶基因具有SEQIDNo：1所示的DNA序列。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述载体选自由载体pET-21(b)、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980组成的载体组。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为pET-28(a)。6.一种N-氨甲酰水解酶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)目的菌的筛选；(2)链霉菌总DNA提取；(3)扩增所述链霉菌总DNA，以获得N-氨甲酰水解酶基因；(4)连接所述N-氨甲酰水解酶基因的DNA片段与表达载体，从而获得N-氨甲酰水...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵德，任丽，任敏，李亚东，金媛媛，王国勤，罗尚菊，易丹，王翠娟，
申请(专利权)人：重庆桑禾动物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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