一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的工程菌及其构建方法。所述枯草芽孢杆菌工程菌，使枯草芽孢杆菌中编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活后获得；所述sleB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；cwlJ基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术首次通过失活芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ弱化芽孢萌发的方式提高芽孢表面展示海藻糖合酶的稳定性，经实际验证，可有效提高海藻糖合酶的酶活，12h内海藻糖合酶酶活可保持95％以上。

Engineering bacteria for stably displaying trehalose synthase on spore surface and construction method thereof

The invention relates to an engineering bacterium stably displaying trehalose synthase on a spore surface and a method for constructing the same. The engineered strain Bacillus subtilis, the cortex lytic enzyme gene sleB encoding and cwlJ spore germination after inactivation of Bacillus subtilis; the sleB gene nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1; cwlJ gene nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.2. For the first time the loss of cortex lytic enzyme gene sleB live spore germination and cwlJ weakening spore germination method to enhance the stability of spore surface display of trehalose synthase by, after the actual verification, can effectively improve the trehalose synthase enzyme activity, 12h trehalose synthase enzyme activity can be maintained above 95%.

【技术实现步骤摘要】
一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的工程菌及其构建方法
本专利技术涉及一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的工程菌及其构建方法，特别涉及一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法，属于生物工程

技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，是革兰氏阳性细菌的典型代表，具有无治病性，表达系统稳定的特点；其细胞壁的组成简单，在细胞壁合成过程中没有内毒素的生成，已经被美国、日本、欧盟和中国认定为安全无毒的菌株，广泛应用于食品、饲料等行业。芽孢(内生孢子或称孢子)是芽孢杆菌营养细胞受到营养缺乏，代谢产物积累，或温度变化等外部环境因子的触发而形成的休眠体，芽孢的形成需要经过一系列复杂的生理生化反应。近年来以芽孢衣壳蛋白为分子载体，通过芽孢表面展示技术将外源目的蛋白展示于重组枯草芽孢杆菌芽孢表面，制备具有生物活性的重组芽孢抗体和酶制剂已成为人们研究和关注的热点。构建重组枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示体系时，利用芽孢衣壳蛋白融合展示海藻糖合酶，将底物麦芽糖转化为海藻糖，不仅能够避免因诱导剂的使用而造成限制，而且融合酶不需要穿过细胞膜，将海藻糖合酶直接应用于高端海藻糖的生产制备中，避免因细胞破碎，杂质分离造成的成本增加及热源物质对海藻糖的污染,该法是海藻糖生产的有效技术手段。但是由于芽孢易受萌发剂刺激而萌发，使展示芽孢在转化麦芽糖制备海藻糖体系中稳定性较差,海藻糖合酶异源表达后，只能利用一次，不能充分回收利用。
技术实现思路
本专利技术主要针对现有技术的不足，提供一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的工程菌及其构建方法。本专利技术技术方案如下：一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，使枯草芽孢杆菌中编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活后获得；所述sleB基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；cwlJ基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。根据本专利技术优选的，所述编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活为通过基因敲除、基因增补、基因替换或基因突变引起编码内切纤维素酶基因celB的启动子、终止子或编码区的变化导致编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ无法表达。上述芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，步骤如下：(i)以枯草芽孢杆菌为模板，进行PCR扩增，分别得到sleB1，cwlJ1片段；sleB1片段扩增的PCR引物序列如下：sleB-up:5’-CGGGATCCCGGGGGATGATGTGGTCGAG-3’；SEQIDNO.3sleB-down:5’-ACTGACTCACTCAAAAATAACCCCCGCTACT-3’；SEQIDNO.4cwlJ1片段扩增的PCR引物序列如下：cwlJ-up:5’-CGGGATCCCGTTCTGAAGTAATGAAATATGATG-3’；SEQIDNO.5cwlJ-down:5’-CTATGGTGTGTGGGAAAAGCAGTGGACTTAAATCT-3’；SEQIDNO.6(ii)以质粒pPIC9k为模板，进行PCR扩增，得到kmr片段；所述的kmr片段PCR扩增引物序列如下：kmr-up:5’-CGGGGGTTATTTTTGAGTGAGTCAGTCATAGGGAG-3’；SEQIDNO.7kmr-down:5’-CGGGATCCCGGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’；SEQIDNO.8(iii)以pPICZαA质粒为模板，进行PCR扩增，得到zeor片段；所述的zeor片段PCR扩增引物序列如下：zeor-up:5’-TAAGTCACACTGCTTTTCCCACACACCATAGCTTCA-3’；SEQIDNO.9zeor-down:5’-CGGGATCCCGGTTGGTCTCCAGCTTGCAAA-3’；SEQIDNO.10(iv)利用重叠PCR技术连接sleB1和kmr片段，制得sleB1-kmr片段，步骤如下：初次PCR扩增，扩增体系如下：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，模板sleB11μl，模板kmr1μl，用ddH2O补足25μl；初次PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3.5min，5个循环；补充PCR扩增，扩增体系如下：向初次扩增后的体系中加入2×TaqPCRMasterMix12.5μl，10μmol/L引物sleB-up1μl，10μmol/L引物kmr-down1μl，用ddH2O补足50μl；补充PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；(v)利用重叠PCR技术连接cwlJ1和zeor片段，制得cwlJ1-zeor片段，步骤如下：初次PCR扩增，扩增体系如下：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，模板cwlJ11μl，模板zeor1μl，用ddH2O补足25μl；初次PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，5个循环；补充PCR扩增，扩增体系如下：向初次扩增后的体系中加入2×TaqPCRMasterMix12.5μl，10μmol/L引物cwlJ-up1μl，10μmol/L引物zeor-down1μl，用ddH2O补足50μl；补充PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；(vi)将步骤(iv)制得的sleB1-kmr片段转化枯草芽孢杆菌获得sleB基因缺失菌后，再将步骤(v)制得的cwlJ1-zeor基因转化sleB基因缺失菌中获得sleB，cwlJ基因双缺失菌株，经筛选，制得芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌。根据本专利技术优选的，所述步骤(i)中，sleB1片段扩增的PCR扩增体系为50μl：2×TaqPCRMasterMix25μl，10μmol/L引物sleB-up2.5μl，10μmol/L引物sleB-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；sleB1片段扩增的PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(i)中，cwlJ1片段扩增的PCR扩增体系为50μl：2×TaqPCRMasterMix25μl，10μmol/L引物cwlJ-up2.5μl，10μmol/L引物cwlJ-down2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；cwlJ1片段扩增的PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(ii)中，所述的kmr片段PCR扩增体系为50μl：2×TaqPCRMasterMix25μl，10μmol/L引物kmr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，使枯草芽孢杆菌中编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活后获得；所述sleB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；cwlJ基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，使枯草芽孢杆菌中编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活后获得；所述sleB基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；cwlJ基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ失活为通过基因敲除、基因增补、基因替换或基因突变引起编码内切纤维素酶基因celB的启动子、终止子或编码区的变化导致编码芽孢萌发的皮层溶解酶基因sleB和cwlJ无法表达。3.权利要求1所述芽孢表面稳定展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：(i)以枯草芽孢杆菌为模板，进行PCR扩增，分别得到sleB1，cwlJ1片段；sleB1片段扩增的PCR引物序列如下：sleB-up:5’-CGGGATCCCGGGGGATGATGTGGTCGAG-3’；sleB-down:5’-ACTGACTCACTCAAAAATAACCCCCGCTACT-3’；cwlJ1片段扩增的PCR引物序列如下：cwlJ-up:5’-CGGGATCCCGTTCTGAAGTAATGAAATATGATG-3’；cwlJ-down:5’-CTATGGTGTGTGGGAAAAGCAGTGGACTTAAATCT-3’；(ii)以质粒pPIC9k为模板，进行PCR扩增，得到kmr片段；所述的kmr片段PCR扩增引物序列如下：kmr-up:5’-CGGGGGTTATTTTTGAGTGAGTCAGTCATAGGGAG-3’；kmr-down:5’-CGGGATCCCGGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’；(iii)以pPICZαA质粒为模板，进行PCR扩增，得到zeor片段；所述的zeor片段PCR扩增引物序列如下：zeor-up:5’-TAAGTCACACTGCTTTTCCCACACACCATAGCTTCA-3’；zeor-down:5’-CGGGATCCCGGTTGGTCTCCAGCTTGCAAA-3’；(iv)利用重叠PCR技术连接sleB1和kmr片段，制得sleB1-kmr片段，步骤如下：初次PCR扩增，扩增体系如下：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，模板sleB11μl，模板kmr1μl，用ddH2O补足25μl；初次PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3.5min，5个循环；补充PCR扩增，扩增体系如下：向初次扩增后的体系中加入2×TaqPCRMasterMix12.5μl，10μmol/L引物sleB-up1μl，10μmol/L引物kmr-down1μl，用ddH2O补足50μl；补充PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；(v)利用重叠PCR技术连接cwlJ1和zeor片段，制得cwlJ1-zeor片段，步骤如下：初次PCR扩增，扩增体系如下：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，模板cwlJ11μl，模板zeor1μl，用ddH2O补足25μl；初次PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，5个循环；补充PCR扩增，扩增体系如下：向初次扩增后的体系中加入2×TaqPCRMasterMix12.5μl，10μmol/L引物cwlJ-up1μl，10μmol/L引物zeor-down1μl，用ddH2O补足50μl；补充PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；(vi)将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王腾飞，韩登兰，王瑞明，汪俊卿，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37