一种提高胞内氧化型辅酶I含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高胞内氧化型辅酶I含量的方法，属于辅因子工程技术领域。本发明专利技术主要针对大肠杆菌中NAD

Method for improving intracellular oxidized coenzyme I content

The invention discloses a method for improving the content of intracellular oxidized coenzyme I, belonging to the technical field of cofactor engineering. The invention mainly aims at NAD in Escherichia coli

【技术实现步骤摘要】
一种提高胞内氧化型辅酶I含量的方法
本专利技术涉及一种提高胞内氧化型辅酶I含量的方法，属于辅因子工程

技术介绍
辅酶I，又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide)，是一种传递电子(氢离子)的辅酶，KEGG数据库显示NADH/NAD+作为重要的辅因子全程参与微生物细胞内的740多个代谢反应，包括氧化还原反应、能量代谢过程、调控基因表达、维持Ca+稳态以及调节细胞衰老等，尤其在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。NAD+能为代谢网络中各种反应提供能量和氧化还原力，其浓度可以调控代谢网络途径，增大代谢流通量，提高氧化还原反应中生物催化效率和目标产物的产率等。NAD+生物合成主要有两条途径：从头合成途径和补救合成途径(图1)。从头合成途径以天冬氨酸或色氨酸为前体，通过一系列步骤生成喹啉酸(QA)，接着经基因nadC编码的喹啉酸磷酸核糖转移酶催化生成烟酸单核苷酸(NaMN)，再由基因nadD编码的腺苷转移酶催化腺苷化生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)，最后在基因nadE编码的NAD+合成酶催化下氨基化成NAD+。补救途径是基因pncA编码的烟酰胺酶水解烟酰胺生成烟酸，再经基因pncB编码的烟酸磷酸核糖转移酶催化烟酸生成烟酸单核苷酸(NaMN)，最后生成NAD+。当细胞内大量存在NAD+前体烟酰胺(NAM)、烟酸(NA)时，补救途径对胞内NAD+的含量起到重要的作用。目前，提高细胞内NAD+含量主要从代谢工程和生化工程两个方向上考虑，其中包括：过量表达NADH代谢相关酶、缺失NADH竞争途径、引入NADH外源代谢途径、添加外源电子受体、不同氧化还原态底物及NAD合成前体物、调节培养环境和氧化还原电势等。大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单且生长周期短等优点，被广泛应用于科研工作中。然而，其细胞内的辅酶含量较低，无法起到增强相关催化反应效率的作用。因此，通过基因工程的手段增强细胞内NAD+含量对于提高胞内氧化型辅酶I的含量具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种共表达pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中至少两个基因的重组大肠杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coliBL21为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是共表达pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的任意三种基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌共表达pncA、nadD、nadE基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌共表达pncB、nadE、nadD基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌共表达nadC、nadD、nadE基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌共表达pncB、nadE、pncA基因。本专利技术的第二个目的是提供所述重组大肠杆菌的构建方法，是以pET-21a为载体，在大肠杆菌E.coliBL21中表达pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的至少2个基因。本专利技术的第三个目的是提供一种提高重组大肠杆菌胞内氧化型辅酶I含量的方法，所述方法是将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，30～37℃培养8～72h。在本专利技术的一种实施方式中，所述接种是按体积比1％的接种量进行接种。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基中还含有终浓度1～100mg/L的色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、烟酸、烟酰胺中的至少一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是在接种后菌体OD600达到0.6-2.0时，加入终浓度为0.1-10mM的IPTG，16-37℃诱导8-48h。本专利技术还提供所述重组大肠杆菌在食品、医药领域生产氧化型辅酶I方面的应用。本专利技术还提供所述方法在生产含氧化型辅酶I的产品中的应用。有益效果：本专利技术通过采用共表达多基因的组合，并且在发酵培养基中添加不同的前体物质，将多基因与多种类的前体物质结合，扩大代谢网络通量，大肠杆菌胞内的辅酶含量在经过代谢工程和生化工程两个手段的调控后可达到20-30μmol/gDCW。相比出发菌株BL21/pET-21a提高了近10倍，NAD+生成的效率明显提高，大肠杆菌胞内NAD+的含量也进一步增加。附图说明图1为辅酶NAD+合成途径示意图，其中NAD+化学结构及其相关中间体(R：核糖体、P：磷酸、Ad：腺嘌呤)化合物的缩写为：L-Trp：L-色氨酸；Asp：天冬氨酸；QA：喹啉酸；NA：烟酸；NaMN：烟酸单核苷酸；NaAD：烟酸腺嘌呤二核苷酸；NAD+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAM：烟酰胺；NR：烟酰胺核苷；NMN：烟酰胺单核苷酸。具体实施方式发酵培养基：NaCl10g/L蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2，以去离子水配制，使用前加入氨苄青霉素100μg/mL。发酵条件：初始温度为37℃，摇床转速为200r/min，菌体OD600达到0.6-2.0时，加入终浓度为0.1-10mM的IPTG，16-37℃诱导8-48h，添加前体物质的浓度为1-100mg/L。实施例1(1)构建过量表达基因pncA、pncB、nadC、nadD、nadE的表达质粒：根据NCBI上报道的大肠杆菌中基因pncA的序列(GeneID:946276)，基因pncB的序列(GeneID:8182321)，基因nadC的序列(GeneID:948869)，基因nadD的序列(GeneID:8180157)，基因nadE的序列(GeneID:8179982)设计上下游引物，并合成带有BamHI和XhoI酶切位点的引物：pncA-F:GGATCCATGCCCCCTCGCGCCCTGTTpncA-R：CCGCTCGAGTTACCCCTGTGTCTCTTCCCAGTCTGpncB-F:CGCGGATCCATGACACAATTCGCTTCTpncB-R:CCGCTCGAGTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGGnadC-F:GGATCCATGCCGCCTCGCCGCTATAACCnadC-R:CTCGAGTTAGCGAAAACGCATTGAAAGGTCGAGTGnadD-F:CGCGGATCCATGAAATCTTTACAGGCTCnadD-R:CCGCTCGAGTCAGCGATACAAGCCTTGTTnadE-F:CGCGGATCCATGACATTGCAACAACAAATnadE-R:CCGCTCGAGTTACTTTTTCCAGAAATCATCG提取E.coliBL21(DE3)的基因组，以其为模板，PCR克隆扩增得到目的基因pncA、pncB、nadC、nadD和nadE片段，反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s；55℃退火30s；72℃分别延伸42s、80s、58s、42s、55s，30个循环；72℃延伸10min。将目的基因产物纯化后，连接到pMD-19T载体，转化筛选阳性克隆并测序。再将载体pET-21a和T载上的目的基因用限制性核酸内切酶BamHI和XhoI酶切90min，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的基因片段和质粒骨架，在T4连接酶作用下16℃连接过夜。然后将连接产物转化JM109克隆宿主感受态细胞，在氨苄青霉素抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胞内氧化型辅酶I含量提高的重组大肠杆菌，其特征在于，共表达pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中至少两个基因的重组大肠杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种胞内氧化型辅酶I含量提高的重组大肠杆菌，其特征在于，共表达pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中至少两个基因的重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是以E.coliBL21为宿主共表达pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中至少两个基因。3.权利要求3所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，以pET-21a为载体，在大肠杆菌E.coliBL21中表达pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的至少2个基因。4.一种提高重组大肠杆菌胞内氧化型辅酶I含量的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1或2所述重组大肠杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆晓清，徐岩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32