磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶生产乙酰-辅酶A衍生化合物的用途制造技术

本发明专利技术提供了在宿主细胞中用于提高乙酰辅酶A和乙酰辅酶A衍生化合物产量的组合物和方法。在一些实施方案中，所述宿主细胞经遗传修饰以包含编码磷酸转酮酶(PK)的异源核苷酸序列以及将乙酰磷酸转换为乙酸根离子的内源酶的功能性破坏。在一些实施方案中，宿主细胞还包含编码磷酸转乙酰酶(PTA)的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，所述将乙酰磷酸转换为乙酸根离子的酶是甘油-1-磷酸酶。在一些实施方案中，所述甘油-1-磷酸酶是GPP1/RHR2。在一些实施方案中，所述甘油-1-磷酸酶是GPP2/HOR2。本发明专利技术所描述的组合物和方法提供了异源生产乙酰辅酶A衍生化合物的有效途径，所述乙酰辅酶A衍生化合物包括但不限制于，类异戊二烯、聚酮化合物、和脂肪酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶生产乙酰-辅酶A衍生化合物的用途本申请要求2013年3月15日提交的申请号为61/800,356的美国临时申请的优先权，其整体内容通过引用并入本文。1.专利
本专利技术涉及在工程化宿主细胞中用于生产乙酰辅酶A衍生化合物的组合物和方法。2.专利技术背景乙酰辅酶A(乙酰-CoA)是合成必要的生物化合物的关键中间体，所述必要的生物化合物包括聚酮化合物，脂肪酸，类异戊二烯，酚类，生物碱，维生素和氨基酸。来源于乙酰辅酶A的代谢产物为初级和次级代谢物，其包括工业效用的化合物。在酵母中，乙酰辅酶A通过丙酮酸盐代谢进行生物合成(图1)。然而，在这种生物合成途径中，所述反应通过丙酮酸羧化酶和/或丙酮酸脱氢酶催化而失去CO2。在工业发酵的设置中，提供对丙酮酸代谢和下游糖酵解的替换物的益处是在丙酮酸盐脱羧反应中产生更少的CO2，从而在终产物中可以捕获更多的碳，因此增加最大理论产量。第二个益处是产生更少的NADH，因此需要明显更少的氧气对它再氧化。这可以通过表达磷酸转酮酶(PK；EC4.1.2.9)连同磷酸转乙酰酶(PTA；EC2.3.1.8)来完成。PK和PTA催化反应将果糖-6-磷酸(F6P)或木酮糖-5-磷酸(X5P)转换为乙酰辅酶A。如图1所示，PK从戊糖磷酸的中间体木酮糖-5-磷酸中，或从上游糖酵解的中间物D-果糖6-磷酸(F6P)中得到。PK将X5P分裂为3-磷酸甘油醛(G3P)和乙酰磷酸，或将F6P分裂为赤藓糖4-磷酸(E4P)和乙酰磷酸。然后PTA将乙酰磷酸转换成乙酰辅酶A。由循环通过转醛醇酶和转酮醇酶的非氧化磷酸戊糖途径网络，G3P可以重新进入下游糖酵解，并且E4P可重新进入磷酸戊糖途径或糖酵解。本申请人之前已经描述了引入PK和PTA酶，可提高异源类异戊二烯的生产效率。参见于2012年11月9日提交的美国专利申请号13/673,819(现为美国专利号8,415,136)，其整体内容通过引用并入本文。特别地，当细胞溶质的乙酰辅酶A仅使用在天然酵母的代谢网络中发生的化学反应来通过葡萄糖合成时，经甲羟戊酸途径将葡萄糖转换为类异戊二烯法呢烯的最大可能化学计量产率为23.6wt％。通过在用于甲羟戊酸生产的代谢网络中包括由乙酰化乙醛脱氢酶(acetaldehydedehydrogenase,acetylating)(ADA；EC1.2.1.10)和利用NADH的HMG-CoA还原酶催化的反应，最大理论化学计量产率提高到25.2wt％。随着PK和PTA的进一步引入，最佳的反应网络的最大理论产率显著增加，能够达到29.8wt％的质量收率或更大。Sondregger等人也描述了PK和PTA在关于酵母菌株利用木糖生产乙醇中的益处。参见Sondregger等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology70(5):2892-2897(2004)，其整体内容通过引用并入本文。异源磷酸转酮酶途径(PK，PTA和ADA)被引入至酿酒酵母(S.cerevisiae)中以解决乙醇的低产量，所述乙醇低产量由来源于树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的NAD(P)H依赖性木糖还酶和NAD+依赖性木糖醇脱氢酶的过表达导致。在两种氧化还原酶反应中的不同辅因子偏好导致了厌氧氧化还原平衡问题，所述问题表现在还原反应中间体木糖醇的大量积累，因此，导致了乙醇的低产量。通过引入磷酸转酮酶途径使得氧化还原代谢平衡，其使得转化为乙醇每木糖一个NADH的净再氧化，并使得乙醇产量提高25％。然而，PK的过表达也导致乙酸根离子(acetate)积累的增多和发酵速率的降低。尽管可以通过将磷酸转酮酶途径与ALD6突变(将乙醛转换为乙酸根离子)相结合而使得一些乙酸根离子积累减少，但是通过重组磷酸转酮酶途径的流量大约是最佳流量的30％，所述最佳流量需要完全消除木糖醇和甘油的积累。作者认为较高活性的磷酸转乙酰酶和/或乙醛脱氢酶可能对阻止基于磷酸转酮酶途径的乙酸根离子形成来说是必要的。因此，尽管引入异源PK途径可使得乙酰辅酶A的衍生化合物产率得到实质性改善，但似乎需要实现该途径的进一步改进，以达到通过PK和PTA的最佳的碳流量(flux)。本文提供的组合物和方法解决了这个需求并且也提供了相关的优势。3.
技术实现思路
本专利技术提供了改进利用磷酸转酮酶(PK)和磷酸转乙酰酶(PTA)的组合物和方法，用于生产工业上有用的化合物。这些组合物和方法基于以下惊人发现：基于磷酸转酮酶途径的乙酸根离子累积起因于为PK催化产物的乙酰磷酸的酶催化水解。乙酰磷酸水解是不需要的副反应，其通过消耗碳，可对来自乙酰辅酶A的任何类型产物的生产产生负面影响，所述衍生自乙酰辅酶A的任何类型产物包括类异戊二烯化合物，聚酮化合物和脂肪酸。在宿主细胞中，通过功能性地扰乱天然酶催化乙酰磷酸水解，而减少乙酸根离子的积累和增加朝向生产乙酰辅酶A的通过PK/PTA途径的碳流量增加。本文提供的组合物和方法进一步以天然酶(即GPP1/RHR2，以及其密切相关的同源物GPP2/HOR2)在酵母中催化乙酰磷酸水解为乙酸根离子的意外发现为基础。这两种酶以前仅仅以具有甘油-1-磷酸酶(EC3.1.3.21；或者被称为“甘油-3-磷酸酶”)活性为特点，因此，这些酶混杂的乙酰-磷酸酶活性是出人意料的。在异源表达PK和PTA的细胞中，编码RHR2和HOR2的基因的一种或两种的缺失导致乙酸根离子的积累减少，其中编码RHR2的基因的单独缺失导致乙酸根离子浓度的实质减少。此外，在工程化为包括PK、PTA和甲羟戊酸途径的细胞中的RHR2基因的缺失使得为乙酰辅酶A衍生的类异戊二烯的法呢烯的产量实质增加。因此，本文提供了经遗传修饰的宿主细胞和它们生产工业上有用的化合物的使用方法。在一方面，本文提供的经遗传修饰的宿主细胞包括：编码磷酸转酮酶(PK；EC4.1.2.9)的异源核酸；和内源酶的功能性破坏(functionaldisruption)，所述内源酶将乙酰磷酸转换为乙酸根离子。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞进一步包括编码磷酸转乙酰酶(PTA；EC2.3.1.8)的异源核酸。在另一方面，本文提供经遗传修饰的宿主细胞，其包括：编码磷酸转乙酰酶(PTA；EC2.3.1.8)的异源核酸；和内源酶的功能性破坏，所述内源酶将乙酰磷酸转换为乙酸根离子。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞进一步包括编码磷酸转酮酶(PK；EC4.1.2.9)的异源核酸。在一些实施方案中，所述将乙酰磷酸转换为乙酸根离子的酶是甘油-1-磷酸酶(EC3.1.3.21)。在一些实施方案中，所述甘油-1-磷酸酶选自由GPP1/RHR2,GPP2/HOR2，及其同源物和变异体组成的组。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞包括GPP1/RHR2的功能性破坏。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞包括GPP2/HOR2的功能性破坏。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞包括GPP1/RHR2和GPP2/HOR2两者的功能性破坏。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞进一步包括编码酰化乙醛脱氢酶(ADA；EC1.2.1.10)的异源核酸。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞进一步包括天然丙酮酸脱氢酶(PDH)本文档来自技高网...

【技术保护点】
经遗传修饰的宿主细胞，包括：(a)编码磷酸转酮酶(PK；EC 4.1.2.9)的异源核酸；和(b)内源酶的功能性破坏，所述内源酶将乙酰磷酸转换为乙酸根离子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 61/800,3561.经遗传修饰的宿主细胞，包括：(a)编码磷酸转酮酶(PK；EC4.1.2.9)的异源核酸；(b)编码磷酸转乙酰酶(PTA；EC2.3.1.8)的异源核酸；和(c)内源甘油-1-磷酸酶(EC3.1.3.21)的功能性破坏，所述酶将乙酰磷酸转换为乙酸根离子；其中从乙酰磷酸到乙酸根离子的转换被功能性破坏。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述甘油-1-磷酸酶选自GPP1/RHR2和GPP2/HOR2。3.根据权利要求2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，GPP1/RHR2被功能性破坏。4.根据权利要求2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，GPP2/HOR2被功能性破坏。5.根据权利要求2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，·GPP1/RHR2，和·GPP2/HOR2的两者，被功能性破坏。6.根据权利要求1所述的经遗传修饰的宿主细胞，所述经遗传修饰的宿主细胞进一步包括编码酰化乙醛脱氢酶(ADA；EC1.2.1.10)的异源核酸。7.根据权利要求6所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述经遗传修饰的宿主细胞能够产生类异戊二烯。8.根据权利要求7所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述经遗传修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸编码用于制备异戊烯焦磷酸的甲羟戊酸(MEV)途径中的一种或多种酶。9.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括利用NADH的HMG-CoA还原酶。10.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括使两分子乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶。11.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括使乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合形成HMG-CoA的酶。12.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将HMG-CoA转换为甲羟戊酸的酶。13.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括使得甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶。14.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将5-磷酸甲羟戊酸转换为5-焦磷酸甲羟戊酸的酶。15.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将5-焦磷酸甲羟戊酸转换为异戊烯焦磷酸的酶。16.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述MEV途径中的一种或多种酶选自HMG-CoA合成酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。17.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含编码MEV途径中的全部酶的多种异源核酸。18.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，编码MEV途径中的一种或多种酶的所述一种或多种异源核酸在单一转录调节因子的控制下。19.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，编码MEV途径中的一种或多种酶的所述一种或多种异源核酸在多个异源转录调节因子的控制下。20.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述经遗传修饰的宿主细胞进一步包含编码酶的异源核酸，所述酶可将异戊烯焦磷酸(IPP)转换为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。21.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中，所述经遗传修饰的宿主细胞进一步包含编码酶的异源核酸，所述酶能使得IPP和/或DMAPP分子缩合形成聚异戊二烯化合物。22.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂·米歇尔·霍金斯，蒂娜·提帕万·马哈特徳伊库勒梅多斯，亚当·利昂·梅多斯，劳伦·芭芭拉·皮肯斯，安娜·戴，安妮·宁·聪，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，道达尔市场服务公司，
类型：发明
国别省市：美国;US