用于高效生成香兰素的经修饰宿主细胞制造技术

本发明专利技术提供了用于改进香兰素和/或葡糖香兰素生成的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。本发明专利技术所述的宿主细胞、组合物和方法提供了异源生成香兰素和/或葡糖香兰素以及可由其中之一或两者合成或生物合成的任何化合物的有效途径。有效途径。有效途径。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高效生成香兰素的经修饰宿主细胞
专利

[0001]本
技术实现思路
涉及特定的遗传修饰、包含其的宿主细胞，以及使用所述宿主细胞生成香兰素和/或葡糖香兰素以及可由其中之一或两者合成或生物合成的任何化合物的方法。专利技术背景
[0001]香兰素是世界上用量最大的香料成分。仅有约1％的香草风味成分供应来自香草兰花的香草提取物。“天然”香兰素需求旺盛，但供应不足，且价格高昂。可替代的、低成本、大批量的“天然”香兰素来源将是调味品市场一个有利可图的补充。通过酵母对糖进行发酵从头生成的香兰素，与目前市场上的替代品相比，具有以更低的成本生成“天然”香兰素的潜力。
[0002]有几种方法可用于通过天然前体(包括除葡萄糖以外的前体)的生物转化来生成“天然”香兰素。一种途径是在某些植物的某些部分大量存在的阿魏酸的生物转化。已鉴定出微生物，其可通过生成香兰素作为中间体的途径分解代谢阿魏酸。可对这些微生物进行工程改造，以减少香兰素进一步分解代谢为不需要的副产物，从而优化香兰素的生成。Gallage et al.,Molecular Plant,8:40
‑
57(2015)。在类似的方法中，更具成本效益的底物丁香酚可被微生物分解代谢为阿魏酸，并进一步分解代谢为香兰素(Gallage等人)。
[0003]未见已知的微生物可天然地将葡萄糖转化为香兰素(Gallage等人)。1998年，开发了一种从葡萄糖到香兰素的酶促路线，所述路线通过3个附加酶促步骤将天然产生的代谢物3
‑
脱氢莽草酸(3
‑/>dehydroshikimate)转化为香兰素：1)脱水以生成原儿茶酸(3,4
‑
二羟基苯甲酸)，2)3
‑
羟基基团的O
‑
甲基化，和3)使羧酸还原成醛。Li and Frost,J.Am.Chem.Soc.,120:10545
‑
10546(1998)。通过表达催化3
‑
DHS脱水酶(AroZ)和儿茶酚
‑
O
‑
甲基转移酶(COMT)的异源酶，在大肠杆菌(E.coli)中生成香草酸(步骤1和步骤2)证明了这一过程。采用由真菌纯化的芳香族羧酸还原酶(ACAR)进行的酶促转化用于在体外将香草酸转化为香兰素。
[0004]Hansen等人证明了通过表达上述酶与异源PPTase的组合，在单一重组生物体酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中由葡萄糖从头生物合成香兰素，所述异源PPTase被鉴定为激活此生物体中的ACAR酶所必需的。Hansen et al.,Appl.Environ.Microbiol.75:2765
–
2774(2009)。此外，它们表达UDP
‑
葡萄糖基转移酶，将有毒的香兰素产品转化为毒性低得多的葡糖香兰素。
[0005]已报道许多其他修饰以提高酵母中香兰素生物合成的效率。为了提高葡糖香兰素的效价(Hansen等人)，证明重要的是通过删除天然还原酶(即，ADH6)来减少内源性还原酶活性，以减少香兰素向香草醇的转化。为了减少碳对不需要的异构体异香兰素(通过4
‑
OH而非3
‑
OH的甲基化生成)的损失，人变体Hs.COMT被用作酶进化的起点。US 2014/0245496；WO 2015/121379。获得对正确香兰素异构体具有高度特异性的突变体。为了增加通向PCA的通量并减少通向莽草酸途径代谢物的通量，生成了Aro1的突变体形式，注释为突变体AROM，其中包含E结构域中的突变，并降低了此反应的活性，所述反应使用3
‑
DHS作为底物来制备莽
草酸。
[0006]可提供低成本、大量来源的“天然”香兰素的进一步遗传修饰将是调味品市场的重要补充。
专利技术摘要
[0007]本专利技术提供了用于改进香兰素和/或葡糖香兰素生成的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。所述这些组合物和方法部分基于某些基因产物的缺失，所述基因产物包括在已经遗传修饰以生成香兰素和/或葡糖香兰素的宿主细胞中的脂肪醛脱氢酶(即，HFD1)的同源物及其同源物类。虽然不打算受任何特定操作理论的束缚，但本专利技术实施例证明HFD1编码能够将香兰素转化为不太需要的香草酸的酶。HFD1的缺失可减少或消除此反应。
[0008]一方面，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞及其用于生成香兰素或葡糖香兰素的方法。在某些实施方案，本专利技术提供了能够生成香兰素或葡糖香兰素的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有脂肪醛脱氢酶(HFD1)同源物的缺失。在特定实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞表达足以生成香兰素或葡糖香兰素的另外的酶。有用的酶描述在本专利技术中。
[0009]另一方面，本专利技术提供了生成香兰素或葡糖香兰素的方法，其包括：在适于制备香兰素或葡糖香兰素的条件下，在含有碳源的培养基中培养本专利技术的宿主细胞的种群以生成培养液(culture broth)；从所述培养液回收所述香兰素或葡糖香兰素。
[0010]另一方面，本专利技术提供了通过本专利技术提供的方法生成的香兰素。在某些实施方案，本专利技术提供的香兰素具有：与PDB(Pee Dee Belemnite)标准品的块体(bulk)δ
13
C偏差为约
‑
14.7
‰
至约
‑
12.8
‰
，与SMOW(标准平均大洋水，Standard Mean Ocean Water)标准品的块体δ2H偏差为约
‑
150
‰
至约
‑
124
‰
，和/或约12.9dpm/g至约14.1dpm/g的
14
C活性。附图简要说明
[0011]图1提供了在液体培养基中香兰素及降解产物香草醇和香草酸的效价(g/L)，起始浓度为1g/L香兰素，针对所示菌株修饰温育24小时。
[0012]图2提供了生成香兰素的菌株Y42688及改进的衍生物Y43188的5天发酵的累积产量(重量％；香兰素+香草醇)和累积生产率(g/L/h；香兰素+香草醇)。累积表示从时间0到指定时间的间隔值。
[0013]图3提供了从蔗糖、葡萄糖或果糖生成香草酸、香兰素、阿魏酸、丁香酚和姜黄素的途径。
[0014]图4提供了衍生自多种原料的香兰素的块体δ
13
C数据比较，表示为与PDB的
‰
偏差，以及表示为与SMOW的
‰
偏差的块体δ2H数据比较。在图4中，使用以下符号：孜然(
■
)、丁香酚(
●
)、阿魏酸(提取自稻米，
◆
)、阿魏酸(提取自玉米，
▲
)、愈创木酚(
□
)、木质素(
○
)、香草豆(
◇
)、葡萄糖(提取自玉米，Δ)、蔗糖(提取自甘蔗，x)。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.能够生成香兰素(vanillin)或葡糖香兰素(glucovanillin)的经遗传修饰的宿主细胞，其包含HFD1的缺失。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的宿主细胞，其不表达Hfd1。3.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含ADH6的缺失。4.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含GRE2的缺失。5.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含YGL039W的缺失。6.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达AroB、AroD和AroZ的一种或多种核酸。7.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达AroB、AroD、AroF和AroZ的一种或多种核酸。8.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达大肠杆菌(E.coli)AroB、大肠杆菌(E.coli)AroD、大肠杆菌(E.coli)AroF和疏毛柄孢壳菌(Podospora pauciseta)AroZ的一种或多种核酸。9.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达PPTASE和ACAR的一种或多种核酸。10.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达谷氨酸棒杆菌(Cornybacterium glutamicum)PPTASE和艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)ACAR的一种或多种核酸。11.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达EAO的一种或多种核酸。12.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达约氏红球菌(Rhodococcus jostii)EAO的一种或多种核酸。13.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达UDP
‑
糖基转移酶(UGT)的一种或多种核酸。14.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)UGT的一种或多种核酸。15.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中每个异源基因均由诱导型启动子表达。16.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中每个异源基因均由GAL启动子表达。17.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中每个异源基因均由GAL启动子表达，和其中GAL80基因由MAL启动子表达。18.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞和植物细胞。19.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
20.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述香兰素是香兰素或葡糖香兰素。21.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述香兰素是葡糖香兰素。22.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其与亲本菌株相比，生成增加至少5％、10％、15％、或20％的峰值累积产量或峰值累积生产率...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：