生产毛喉素的重组酿酒酵母菌及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种生产毛喉素的重组酿酒酵母菌及构建方法，构建方法为：向酿酒酵母菌中导入优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS2和tCfTPS3，得到重组菌1；再以重组菌1为基础依次导入相关基因制备出重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6和重组菌7，实验证明，本发明专利技术的生产毛喉素的重组酿酒酵母，发酵使得毛喉素摇瓶产量达到18.37mg/L以上，为人工合成毛喉素奠定了基础。喉素奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
生产毛喉素的重组酿酒酵母菌及构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及生产毛喉素的重组酿酒酵母菌及构建方法及用途。

技术介绍

[0002]毛喉素(Forskolin)，一种半日花烷型的杂环二萜类天然产物，存在于毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii的根软木组织中。由于毛喉素作为腺苷酸环化酶的激活剂，提高了细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的浓度，所以毛喉素目前已经被研究发现的医药应用价值有：缓解青光眼、治疗哮喘、抗肿瘤、抗HIV、治疗心力衰竭及降压、减肥的功效等。由于植物原材料有限，毛喉素的生产显得供不应求，而毛喉素的化学合成过程步骤繁琐，且对环境不友好。
[0003]随着合成生物学的发展，以分子生物学为手段，对基因进行改造，构建外源代谢途径或调节内源途径，以廉价的碳源作为底物，通过大规模发酵生产萜类化合物，既避免了植物提取法对资源的浪费，又避免了化学合成法复杂的工序，减少了对环境的危害等问题。因此，利用合成生物学方法来生产萜类化合物越来越重要。目前，利用合成生物学方法，通过分子生物学手段，基因改造微生物可以实现目标产物的有效积累，但从系统代谢角度进行毛喉素生物合成路径优化来生产毛喉素还未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产毛喉素的重组酿酒酵母菌。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种生产毛喉素的重组酿酒酵母菌的构建方法。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种生产毛喉素的重组酿酒酵母菌发酵生产毛喉素的用途。
[0007]本专利技术的技术方案概述如下：
[0008]生产毛喉素的重组酿酒酵母菌的构建方法，包括如下步骤：
[0009](1)向酿酒酵母中导入含有优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS2和优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS3的表达盒，得到重组菌1；
[0010]所述优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0011]所述优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012](2)向重组菌1中导入截短的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因BTS1和法呢基焦磷酸合酶编码突变基因ERG20
F96C
表达盒，得到重组菌2；
[0013]所述截短的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0014]所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因BTS1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0015]所述法呢基焦磷酸合酶编码突变基因ERG20
F96C
的核苷酸序列如SEQ ID No.5所
示；
[0016](3)向重组菌2中导入含有优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH15、优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH11、优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH16，优化的细胞色素P450还原酶编码基因CfCPR和优化的乙酰基转移酶编码基因CfACT1
‑
8的表达盒，得到重组菌3；
[0017]所述优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH15的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH11的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH16的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因CfCPR的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述优化的乙酰基转移酶编码基因CfACT1
‑
8的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
[0018](4)向重组菌3中导入含优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS2、优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS3、截短的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因BTS1和法呢基焦磷酸合酶编码突变基因ERG20
F96C
的表达盒得到重组菌4；
[0019](5)向重组菌4中导入含有CfCYP76AH15～t66CPR～t30CYB5、fCYP76AH11～t66CPR～t30CYB5、CfCYP76AH16～t66CPR～t30CYB5和CfACT1
‑
8表达盒，得到重组菌5；
[0020]所述t66CPR是CfCPR从N端截短了60个氨基酸后获得；
[0021]所述t30CYB5是细胞色素CYB5从C端截短了30个氨基酸后获得，细胞色素CYB5的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
[0022](6)向重组菌5中导入内质网调控因子INO2表达盒，得到重组菌6；
[0023]所述内质网调控因子INO2的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
[0024](7)向重组菌6中导入含有6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因ZWF1，磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因GND1，乙醛脱氢酶编码基因ALD6和乙酰辅酶A合酶编码基因ACS的表达盒，得到重组菌7；
[0025]所述6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因ZWF1的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因GND1的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述乙醛脱氢酶编码基因ALD6的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述乙酰辅酶A合酶编码基因ACS的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
[0026]酿酒酵母优选酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303
‑
1a。
[0027]上述方法构建的生产毛喉素的重组酿酒酵母菌。
[0028]上述重组酿酒酵母菌发酵生产毛喉素的用途。
[0029]实验证明，本专利技术的生产毛喉素的重组酿酒酵母，发酵使得毛喉素摇瓶产量达到18.37mg/L以上，为人工合成毛喉素奠定了基础。
附图说明
[0030]图1为毛喉素HPLC
‑
MS检测图，其中a是液相图，b为质谱图。
具体实施方式
[0031]下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。
[0032]下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]本专利技术所用的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303
‑
1a(ATCC：208352)(购买时间，2016.6，网址：https://www.atcc.org/)为出发菌株。
[0034]酿酒酵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.生产毛喉素的重组酿酒酵母菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)向酿酒酵母中导入含有优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS2和优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS3的表达盒，得到重组菌1；所述优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的泪柏醚合酶编码基因tCfTPS3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；(2)向重组菌1中导入截短的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因BTS1和法呢基焦磷酸合酶编码突变基因ERG20
F96C
表达盒，得到重组菌2；所述截短的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因BTS1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述法呢基焦磷酸合酶编码突变基因ERG20
F96C
的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；(3)向重组菌2中导入含有优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH15、优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH11、优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH16，优化的细胞色素P450还原酶编码基因CfCPR和优化的乙酰基转移酶编码基因CfACT1
‑
8的表达盒，得到重组菌3；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH15的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH11的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CfCYP76AH16的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因CfCPR的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述优化的乙酰基转移酶编码基因CfACT1
‑
8的核苷酸序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，鞠海燕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：