一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种酿酒酵母基因工程菌，是通过将酿酒酵母菌中的GAL4启动子替换为铜离子抑制启动子pCTR1或pCTR3，将GAL80启动子替换为铜离子诱导启动子pCUP1构建而成，该工程菌在种子培养期，受铜离子作用会抑制GAL基因调控系统中控制外源基因的pGAL1，pGAL2，pGAL7和pGAL10启动子的表达，避免了产物过早生产，显著提高了传代稳定性。而且该工程菌的GAL基因调控系统不受半乳糖浓度的影响，提高了萜类化合物生物表达，其构建方法简单，生产成本低，发酵生产阶段，无需添加任何诱导剂即可实现目标产物的生产，适合大规模生产，该工程菌在萜类化合物的生产领域有着巨大的应用前景。类化合物的生产领域有着巨大的应用前景。类化合物的生产领域有着巨大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]酿酒酵母是国际公认的安全模式菌株且遗传操作方法成熟，酿酒酵母被广泛地应用于生物类产品、高附加值天然产物及饲料的添加剂的生产。但生产过程中基因过早的泄露表达，会导致外源代谢途径中间产物和蛋白的积累，对宿主细胞造成毒害作用，菌株出于自我保护机制，会通过基因突变的方式将外源基因去除掉，出现所谓的菌株退化，进而生产效率大大降低。因此避免目的基因过早泄露表达是构建酿酒酵母工程菌过程中必须考虑的。
[0003]酿酒酵母自身内源的GAL调控系统，是通过GAL4和GAL480蛋白影响着 GAL基因的转录与表达，其中GAL4是转录调节相关的蛋白，GAL4蛋白的表达受SNF1网络和GAL80蛋白的调控，当存在葡萄糖时，SNF1抑制GAL4蛋白的表达从而导致GAL基因不表达；当不存在葡萄糖时，且不存在半乳糖，GAL4 蛋白被GAL80蛋白结合，使得GAL40蛋白不能结合GAL基因的启动子区；当存在半乳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：在所述酿酒酵母基因工程菌的GAL基因调控系统中，GAL4的启动子包括pCTR1或者pCTR3中的任一种，GAL80的启动子包括为pCUP1；所述pCTR1的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；所述pCTR3的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.3所示。2.如权利要求1所述的一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：所述pCTR1或者pCTR3替换的GAL4的启动子为GAL4基因起始密码子前456bp，核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述pCUP1替换的GAL80的启动子为GAL80基因起始密码子前426bp，核苷酸序列如SEQ NO.5所示。3.如权利要求2所述的一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：在一定铜离子浓度下，所述GAL基因调控系统中控制外源基因表达的启动子pGAL1，pGAL2，pGAL7或者pGAL10被抑制表达。4.一种如权利要求1
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3任一项所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤S1、构建含启动子pCTR1的GAL4模块重组质粒pCuZ100，或者构建含启动子pCTR3的GAL4模块重组质粒pCuZ101；S2、构建含启动子pCUP1的GAL80模块重组质粒pCuZ102；S3、将步骤S1和步骤S2所得的重组质粒转入宿主菌酿酒酵母中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR1和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；或者通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR3和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；即得到酿酒酵母基因工程菌。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤S3中，所述宿主菌酿酒酵母包括酿酒酵母30000B、酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2
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1D、酿酒酵母BY4741和酿酒酵母GS
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A3中的任一种；所述GS
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A3于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为.CCTCC NO:M20211191。6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：构建重组质粒pCuZ100的方法包括以下步骤：S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4
‑
left
‑
F和pGAL4
‑
left
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R、pCTR1
‑
F和pCTR1
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R、pGAL4
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right
‑
F和pGAL4
‑
right
‑
R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4
‑
left、pCTR1和pGAL4
‑
right；S2、以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418
‑1‑
F和G418
‑1‑
R进行PCR反应，获得G418表达盒G418
‑
1；S3、将步骤S1获得的DNA片段pGAL4
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left、pCTR1和pGAL4
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right和步骤S2获得的表达盒G418
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1，通过用引物pGAL4left
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F和pGAL4
‑
right
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R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR1；S4、将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR1与质粒pMD19
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T连接，获得重组质粒载体，记为p...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈强，刘登辉，向景，刘传春，
申请(专利权)人：湖北冠众通科技有限公司，
类型：发明
国别省市：