本发明专利技术公开了一种高表达细胞色素P450的重组酵母及其应用。一种高表达细胞色素P450的重组酵母，将来源于拟南芥的AtGRP7、AtMSBP1和AtCOL4中的至少一个基因在酵母中过表达获得所述重组酵母。本发明专利技术构建的利用拟南芥cDNA过表达文库以提高细胞色素P450表达的酿酒酵母平台菌株构建方法，利用产甜菜黄素的生物传感器和拟南芥cDNA过表达文库，通过菌株颜色及荧光的变化，成功筛选来源于拟南芥的能提高CYP76AD1表达的靶标基因。同时，将这些靶标基因应用于其他P450，证明其通用性，说明该方法能有效建立一个平台酵母菌株，用于多种P450的功能表达。功能表达。功能表达。
【技术实现步骤摘要】
一种高表达细胞色素P450的重组酵母及其应用
[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别是涉及一种高表达细胞色素P450的重组酵母及其应用。
技术介绍
[0002]细胞色素P450酶(P450)是广泛存在于动物、植物和微生物中的血红素
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硫醇盐蛋白超家族。由于氧化、环氧化、羟基化和去甲基化等多种生物催化活性，P450在代谢网络中发挥着重要作用，且参与了许多天然产物的生物合成，例如阿片类药物、青蒿酸和甘草次酸等。作为研究透彻的模式生物，酿酒酵母具有遗传背景清晰、易于培养和翻译后加工能力等优点。因此，酿酒酵母通常是P450功能表达和天然产物生物合成的首选宿主。
[0003]尽管多种P450已在酿酒酵母中成功表达，比如，公开号为CN106987533A的专利技术公开了一种能够合成甘草次酸的酿酒酵母工程菌的构建方法。将来源于光果甘的β香树脂醇合酶基因GgbAS、细胞色素P450氧化酶基因CYP88D6和CYP72A154及来源于拟南芥的细胞色素P450氧化还原酶基因CPR1和CPR2分别构建形成基因表达盒，然后共转化基因表达盒于酿酒酵母CEN.PK2 1C中，利用酵母同源重组能力组装形成具有完整甘草次酸生物合成途径的酿酒酵母工程菌，实现了酿酒酵母酵母中甘草次酸的人工合成。
[0004]但低表达水平和活性已成为P450研究和应用的最大挑战。目前通过N端截短，P450的蛋白质分子修饰，以及与细胞色素P450还原酶(CPR)共表达等不同的策略已经实现不同P450表达水平和活性的提高，但是这些策略无法适用于大部分的P450，缺乏通用性(Jiang,L.,Huang,L.,Cai,J.,Xu,Z.,Lian,J.(2021).Functional expression of eukaryotic cytochrome P450s in yeast.Biotechnol.Bioeng.118,1050
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1065.)。因此，非常需要开发一种普遍适用的策略以构建酿酒酵母平台菌株来改进P450在酵母中的表达。
[0005]植物中存在多种P450，能与多种底物相互作用，参与生物碱、萜类、黄酮类、脂肪酸、植物激素和信号分子的合成和降解。因此，植物已经进化出一个复杂的基因调控系统来控制P450的表达和折叠。推测参与植物调控网络的关键基因的引入应该有助于酵母中一系列P450的功能表达。
技术实现思路
[0006]本专利技术针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种高表达细胞色素P450的重组酵母及其应用。
[0007]一种高表达细胞色素P450的重组酵母，将来源于拟南芥的AtGRP7、AtMSBP1和AtCOL4中的至少一个基因在酵母中过表达获得所述重组酵母。优选的，所述的重组酵母，将来源于拟南芥的AtGRP7、AtMSBP1和AtCOL4三个基因在酵母中过表达获得所述重组酵母。优选的，所述的重组酵母，所述AtGRP7、AtMSBP1和AtCOL4的GenBank号分别为NM_127738.5、NM_124603.4和LR782546.1。优选的，所述的重组酵母，还包括细胞色素P450基因。更优选的，所述的重组酵母，包括以下一种：
[0008](1)细胞色素P450基因为CYP76AD1、CYP76AD5或CYP76AD6，所述重组酵母还过表达DOD基因，CYP76AD1和DOD基因的GenBank号分别为KU644144.1和KM502867.1；CYP76AD5和CYP76AD6基因的GenBank号分别为KM592961.1和KM592962.1所示；
[0009](2)细胞色素P450基因为CYP736A167，所述重组酵母还过表达檀香烯合酶SAS基因、AtCPR2基因，及MVA途径相关基因表达框：tHMG1
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ERG8
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ERG13
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ERG20
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ERG12和EGR10
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MVD1
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IDI1
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tHMG1，其中，CYP736A167基因的GenBank号为KU169302.1，檀香烯合酶SAS基因序列如SEQ ID No.2所示，AtCPR2基因的GenBank号为KC842188.1，tHMG1
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ERG8
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ERG13
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ERG20
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ERG12基因的GenBank号分别为NM_001182434.1，NM_001182727.1，NM_001182489.1，NM_001181600.1和NM_001182715.1，EGR10
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MVD1
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IDI1
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tHMG1基因的GenBank号分别为NM_001183842.1，NM_001183220.1，NM_001183931.1和NM_001182434.1；
[0010](3)细胞色素P450基因为F3H，所述重组酵母还过表达AtCPR1基因，其中，F3H基因的GenBank号为NM_114983.3所示，AtCPR1基因的GenBank号为NM_001203894.1；
[0011](4)细胞色素P450基因为T16H2，T3O和D4H，所述重组酵母还过表达AtCPR1、16OMT、T3R、NMT和DAT基因，其中，T16H2基因的GenBank号为JF742645.1，T3O基因的GenBank号为KP122967.1，D4H基因的GenBank号为U71605.1，AtCPR1基因的GenBank号为NM_001203894.1，16OMT基因的GenBank号为EF444544.1，T3R基因的GenBank号为KP122966.1，NMT基因的GenBank号为HM584929.1，DAT基因的GenBank号为AF053307.1。
[0012]本专利技术又提供了所述重组酵母在高表达细胞色素P450中的应用。其中，细胞色素P450基因为CYP76AD1、CYP76AD5或CYP76AD6。本专利技术还提供了所述重组酵母在制备Z
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α
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檀香醇中的应用，其中，细胞色素P450基因为CYP736A167。本专利技术还提供了所述重组酵母在催化柚皮素合成二氢黄酮醇中的应用，其中，细胞色素P450基因为F3H。本专利技术还提供了所述重组酵母在催化它波宁合成文多灵中的应用，其中，细胞色素P450基因为T16H2，T3O和D4H。
[0013]本专利技术构建的利用拟南芥cDNA过表达文库以提高细胞色素P450表达的酿酒酵母平台菌株构建方法，利用产甜菜黄素的生物传感器和拟南芥cDNA过表达文库，通过菌株颜色及荧光的变化，成功筛选来源于拟南芥的能提高CYP76AD1表达的靶标基因。同时，将这些靶标基因应用于其他P450，证明其通用性，说明该方法能有效建立一个平台酵母菌株，用于多种P450的功能表达。
附图说明
[本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高表达细胞色素P450的重组酵母，其特征在于，将来源于拟南芥的AtGRP7、AtMSBP1和AtCOL4中的至少一个基因在酵母中过表达获得所述重组酵母。2.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，将来源于拟南芥的AtGRP7、AtMSBP1和AtCOL4三个基因在酵母中过表达获得所述重组酵母。3.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述AtGRP7、AtMSBP1和AtCOL4的GenBank号分别为NM_127738.5、NM_124603.4和LR782546.1。4.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，还包括细胞色素P450基因。5.如权利要求4所述的重组酵母，其特征在于，包括以下一种：(1)细胞色素P450基因为CYP76AD1、CYP76AD5或CYP76AD6，所述重组酵母还过表达DOD基因，CYP76AD1和DOD基因的GenBank号分别为KU644144.1和KM502867.1；CYP76AD5和CYP76AD6基因的GenBank号分别为KM592961.1和KM592962.1所示；(2)细胞色素P450基因为CYP736A167，所述重组酵母还过表达檀香烯合酶SAS基因、AtCPR2基因，及MVA途径相关基因表达框：tHMG1
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ERG8
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ERG20
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ERG12和EGR10
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MVD1
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IDI1
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tHMG1，其中，CYP736A167基因的GenBank号为KU169302.1，檀香烯合酶SAS基因序列如SEQ ID No.2所示，AtCPR2基因的GenBank号为KC842188.1，tHMG1
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ERG8
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ERG13
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ERG20
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ERG12基因中tHMG1、ERG8、ERG13、ERG20和ERG12的GenBank号分别为NM_0011824...
【专利技术属性】
技术研发人员：连佳长，江丽红，董昌，刘腾飞，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：
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