一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，是利用同源重组的方式在酿酒酵母中整合表达MVA途径限速酶

【技术实现步骤摘要】
一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]瓦伦烯(Valencene)，分子式：C
15
H
24
，又名瓦伦西亚烯，巴伦西亚橘烯，朱栾倍半萜，是一种倍半萜烯，是柑橘类水果和柑橘类香精的主要香气成分，主要通过冷榨柑橘类水果皮获得。瓦伦烯作为香料，广泛应用于食品、化妆品行业，同时又可以作为前体分子来生产诺卡酮(Nootkatone)，诺卡酮通常是通过瓦伦烯的化学或生物化学氧化从葡萄柚中提取的，有很高的的经济价值和药用价值。
[0003]瓦伦烯可以从植物中分离提取，但提取步骤繁琐，且质量与原料息息相关，又因为瓦伦烯的场景运用往往与人接触密切，经化学方法合成的瓦伦烯在运用上受到极大限制。除此之外，微生物发酵也是瓦伦烯的一个来源，微生物发酵法生产的瓦伦烯相对安全，而且生产具有条件温和，不受地理和气候影响和容易进行大规模生产等优势。
[0004]目前生物发酵生产瓦伦烯的菌株主要是利用转化了瓦伦烯合成酶的大肠杆菌工程菌和酿酒酵母菌工程菌，但产量都偏低，在10mg/L左右，远没有达到工业生产的水平。而且大肠杆菌发酵生产的时候会产生内毒素，后期不好分离，生产用在与人密切接触的瓦伦烯，处于劣势。而酿酒酵母是国际公认的安全模式菌株且遗传操作方法成熟，有天然的优势。因此，构建高产稳定的瓦伦烯酿酒酵母生产菌株，具有重要的经济价值和社会意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0007]本专利技术提供的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0008]步骤S1，构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1
‑
10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1
‑
10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如 SEQ NO.2所示；
[0009]步骤S2，构建瓦伦烯生产相关基因表达模块：ERG20
‑
Linker
‑
SmVS模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和瓦伦烯合成酶的编码基因SmVS，所述 ERG20的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述SMVS的核苷酸序列如SEQ NO.4 所示；
[0010]步骤S3，构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1 所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述瓦伦烯生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白 GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至构建的酿酒酵母基因工程菌GS
‑
A3中，经多次基因工程操作，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的
基因工程菌；
[0011]步骤S4，构建角鲨烯合酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子 pCUP1替换为角鲨烯合酶基因ERG9启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鲨烯合酶基因ERG9启动子取至ERG9基因起始密码子前 450bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示；
[0012]步骤S5，将步骤S5所述角鲨烯合酶途径下调表达质粒转化至步骤S3所述的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR验证，获得高产瓦伦烯基因工程菌；
[0013]所述构建方法还包括两个终止子tCYC1和tERG20，所述终止子tCYC1的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，所述终止子tERG20的核苷酸序列如SEQ NO.8 所示。
[0014]进一步的，在步骤S1中，所述过表达tHMG1模块的构建方法包括以下步骤：
[0015]步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用tCYC1
‑
F和 tCYC1
‑
R、tHMG1
‑
F和tHMG1
‑
R、pGAL1pGAL10
‑
F和pGAL1pGAL10
‑
R引物进行PCR反应，获得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；
[0016]步骤S2，将步骤S1获得的三个DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通过用引物tCYC1
‑
F和pGAL1pGAL10
‑
R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得过表达tHMG1模块，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模块。
[0017]进一步的，步骤S2中，所述ERG20
‑
Linker
‑
SmVS模块的构建方法包括以下步骤：
[0018]步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用ERG20
‑
F和ERG20
‑ꢀ
Linker
–
W
‑
R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段ERG20_Linker；
[0019]步骤S2，用引物tERG20
‑
W
‑
F和tERG20
‑
R进行PCR反应，扩增得到DNA 片段tERG20；
[0020]步骤S3，以质粒pGZ221为模板，用引物Linker
‑
SmVS
‑
F和SmVS
‑
R进行 PCR反应，扩增得到DNA片段Linker_SmVS；
[0021]步骤S4，将步骤S1获得的DNA片段ERG20_Linker、步骤S2获得的DNA 片段tERG20和步骤S3获得的DNA片段Linker_SmVS，通过用引物ERG20
‑
F 和tERG20
‑
R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得融合表达 ERG20
‑
Linker
‑
SmVS模块，即ERG20_Linker_SmVS_tERG20。
[0022]进一步的，所述Linker包括甘氨酸和丝氨酸，其组合结构包括GSG、GGGS 和GSGGSG中的任一种，其中G对应核酸序列GGT，S对应核酸序列TCT。
[0023]进一步的，在步骤S2中，所述ERG20
‑
Linker
‑
SmVS模块中的Linker为 GSGGSG。
[0024]进一步的，在步骤S3中，所述构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块的构建方法包括以下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1
‑
10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1
‑
10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；S2、构建瓦伦烯生产相关基因表达模块：ERG20
‑
Linker
‑
SmVS模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和瓦伦烯合成酶的编码基因SmVS，所述ERG20的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述SmVS的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；S3、构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述瓦伦烯生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至构建的酿酒酵母基因工程菌GS
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A3中，经多次基因工程操作，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌；S4、构建角鲨烯合酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子pCUP1替换为角鲨烯合酶基因ERG9启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鲨烯合酶基因ERG9启动子取至ERG9基因起始密码子前450bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示；S5、将步骤S5所述角鲨烯合酶途径下调表达质粒转化至步骤S3所述的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR验证，获得高产瓦伦烯基因工程菌；所述构建方法还包括两个终止子tCYC1和tERG20，所述终止子tCYC1的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，所述终止子tERG20的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。2.如权利要求1所述的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述过表达tHMG1模块的构建方法包括以下步骤：S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用tCYC1
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F和tCYC1
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R、tHMG1
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F和tHMG1
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R、pGAL1pGAL10
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F和pGAL1pGAL10
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R引物进行PCR反应，获得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；S2、将步骤S1获得的三个DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通过用引物tCYC1
‑
F和pGAL1pGAL10
‑
R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得过表达tHMG1模块，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模块。3.如权利要求1所述的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述ERG20
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Linker
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SmVS模块的构建方法包括以下步骤：S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用ERG20
‑
F和ERG20
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Linker
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W
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R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段ERG20_Linker；S2、用引物tERG20
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W
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F和tERG20
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R进行PCR反应，扩增得到DNA片段tERG20；S3、以质粒pGZ221为模板，用引物Linker
‑
SmVS
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F和SmVS
‑
R进行PCR反应，扩增得到DNA片段Linker_SmVS；S4、将步骤S1获得的DNA片段ERG20_Linker、步骤S2获得的DNA片段tERG20和步骤S3获得的DNA片段Linker_SmVS，通过用引物ERG20
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F和tERG20
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R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得融合表达ERG20
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Linker
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SmVS模块，即ERG20_Linker_SmVS_tERG20。
4.如权利要求3所述的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：Linker包括甘氨酸和丝氨酸，其组合结构包括GSG、GGGS和GSGGSG中的任一种，其中G对应核酸序列GGT，S对应核酸序列TCT。5.如权利要求4所述的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述ERG20
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Linker
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈强，刘登辉，向景，刘传春，
申请(专利权)人：湖北冠众通科技有限公司，
类型：发明
国别省市：