一种利用甲醇生物转化的重组解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开一种利用甲醇生物转化的重组解脂耶氏酵母基因工程菌，其是在宿主菌解脂耶氏酵母的基因组中导入甲醇氧化酶基因aox、过氧化氢酶基因cta、二羟丙酮合酶基因das、二羟丙酮激酶基因dak、木糖还原酶基因xyr、木糖醇脱氢基因xdh、木酮糖激酶基因xyk、1,6

【技术实现步骤摘要】
一种利用甲醇生物转化的重组解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，特别涉及利用甲醇生物转化的重组解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建和应用。

技术介绍

[0002]随着代谢工程的迅猛发展以及合成生物学的崛起，人类改造微生物作为细胞工厂进行生物制造的能力显著提高。近年来，随着化石资源的日益枯竭，甲醇作为可再生生物质原料在生物转化领域有着巨大的商业价值和市场潜力。开发非传统碳源甲醇的生物转化利用正日益受到国内外研究者的重视，不仅可以降低工业生物转化的原料成本，还可以更好地合理利用甲醇资源。目前在天然甲基营养菌中已打通甲醇到氨基酸、甲羟戊酸、戊二胺以及单细胞蛋白等多种化学品的生物合成路线，由于天然甲基营养型菌株存在耐受性差、不能以甲醇为唯一碳源以及利用效率低等问题，相对来说模式菌株例如大肠杆菌、酿酒酵母等模式微生物的代谢网络清晰、遗传改造工具成熟，更有利于作为底盘细胞实现甲醇到各种化学品的生物合成。然而模式菌株仍然存在耐受性差，利用效率低等问题。有研究报道解脂耶氏酵母能够以乙醇为碳源产柠檬酸，可见解脂耶氏酵母能够产大量的醇脱氢酶，且其耐酸能力较强、基因工程改造手段成熟，因此将解脂耶氏酵母作为底盘细胞，将毕赤酵母中的甲醇代谢路径引入其中，有望实现甲醇到高附加值产物的生物转化。
[0003]CN 201710796917.0公开一种生物转化甲醇代谢途径，在大肠杆菌中人工构建甲醇的代谢途径，该途径简洁，只需两步即可进入大肠杆菌的中央代谢途径。并通过对其途径上的关键酶—甲醛裂合酶(formolase)进行了定向进化，通过全细胞催化得筛选得到了有益突变克隆子，提高了甲醛裂合酶的酶活，然后组装代谢途径上的相关基因，得到了甲醇利用工程菌，在以甲醇为唯一碳源的培养基中进行培养，并通过培养基的优化以及基因敲除等手段实现了甲醇的高效利用。
[0004]柠檬酸是一种广泛分布于动植物与微生物细胞中的有机酸，其用途较为广泛，如在食品行业，可作为pH调节剂、酸味剂、抗氧化剂；在医药领域，可用作矫味剂以及抗凝血剂；在化学工业领域，可用作调色剂、缓冲剂以及凝胶剂。若能以廉价的还原性的底物甲醇为原料，可以在一定程度上降低成本。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术的目的在于提供一种利用合成生物学的方法构建可以利用甲醇进行代谢的菌株，并利用该菌株发酵产柠檬酸，解决了传统产柠檬酸成本高的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术提出了一种利用甲醇生物转化的重组解脂耶氏酵母基因工程菌，其是在宿主菌解脂耶氏酵母的基因组中导入甲醇氧化酶基因aox、过氧化氢酶基因cta、二羟丙酮合酶基因das、二羟丙酮激酶基因dak、木糖还原酶基因xyr、木糖醇脱氢基因xdh、木酮糖激酶
基因xyk、1,6
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果糖双磷酸酶基因fbp、1,6
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二磷酸果糖醛缩酶基因fba和转醛缩酶基因tal后得到，其中，所述木糖还原酶基因xyr、木糖醇脱氢基因xdh和木酮糖激酶基因xyk来源于季也蒙毕赤酵母。
[0008]其中，所述甲醇氧化酶基因aox的NCBI
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GeneID为8201223；所述二羟丙酮合酶基因das的NCBI
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GeneID为8199663；所述过氧化氢酶基因cta的NCBI
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GeneID为8198267；所述二羟丙酮激酶基因dak的NCBI
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GeneID为8200330；所述木糖还原酶Xyr的NCBI
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GeneID为5127438；所述木糖醇脱氢酶Xdh的NCBI
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GeneID为MF139767.1；所述木酮糖激酶Xyk的NCBI
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GeneID为5124047；所述1,6
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果糖双磷酸酶fbp的NCBI
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GeneID为8196585；所述1,6
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二磷酸果糖醛缩酶fba的NCBI
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GeneID为8198238；所述转醛缩酶基因tal的NCBI
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GeneID为8199670。
[0009]优选地，所述宿主菌为解脂耶氏酵母Po1f(Yarrowia lipolytica Po1f)。
[0010]本专利技术进一步提出了上述重组解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0011](1)向解脂耶氏酵母Po1f(Yarrowia lipolytica Po1f)的基因组中导入甲醇代谢模块得到菌株Y001，所述甲醇代谢模块包含甲醇氧化酶基因aox、过氧化氢酶基因cta、二羟丙酮合酶基因das、和二羟丙酮激酶基因dak；
[0012](2)在Y001基础上导入季也蒙毕赤酵母来源的木糖代谢模块，进一步结合人工驯化，得到可以利用木糖作为唯一碳源的菌株Y002，所述季也蒙毕赤酵母来源的木糖代谢模块包含木糖还原酶基因xyr、木糖醇脱氢基因xdh和木酮糖激酶基因xyk；
[0013](3)将毕赤酵母中木酮糖
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磷酸再生的关键基因1,6
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果糖双磷酸酶基因fbp、1,6
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二磷酸果糖醛缩酶基因fba和转醛缩酶基因tal引入菌株Y002中，得到重组解脂耶氏酵母基因工程菌Y003。
[0014]具体地，步骤(1)中，构建TEF
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aox1
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CYC1t、TEF
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das
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tCYC1、PDC1p
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cta
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TDH2t、pGPD
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dak
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TXPR2表达框，通过多片段克隆的方法，将四个表达框与113质粒连接并转化至E.coli DH5α中。将测序正确的质粒通过酶切得到基因重组片段，将基因重组片段转化至宿主菌中得到菌株Y001；步骤(2)中，构建TEF
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xyr
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CYC1t、TEF
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xdh
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CYC1t、TEF
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xyk
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CYC1t表达框，通过多片段克隆的方法，将三个表达框与Pki质粒链接转化至E.coli DH5α中，将测序正确的质粒通过酶切得到基因重组片段，将基因重组片段转化至宿主菌中得到菌株Y002；步骤(3)中，构建TEF
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fbp
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CYC1t、TEF
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Fba
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CYC1t、TEF
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Tal
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CYC1t表达框，通过多片段克隆的方法，将三个表达框与PAN1312质粒链接转化至E.coli DH5α中，将测序正确的质粒通过酶切得到基因重组片段，将基因重组片段转化至宿主菌中得到菌株Y003。
[0015]本专利技术进一步提出了上述重组解脂耶氏酵母基因工程菌在发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用甲醇生物转化的重组解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是在宿主菌解脂耶氏酵母的基因组中导入甲醇氧化酶基因aox、过氧化氢酶基因cta、二羟丙酮合酶基因das、二羟丙酮激酶基因dak、木糖还原酶基因xyr、木糖醇脱氢基因xdh、木酮糖激酶基因xyk、1,6
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果糖双磷酸酶基因fbp、1,6
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二磷酸果糖醛缩酶基因fba和转醛缩酶基因tal后得到，其中，所述木糖还原酶基因xyr、木糖醇脱氢基因xdh和木酮糖激酶基因xyk来源于季也蒙毕赤酵母。2.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述甲醇氧化酶基因aox的NCBI
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GeneID为8201223；所述二羟丙酮合酶基因das的NCBI
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GeneID为8199663；所述过氧化氢酶基因cta的NCBI
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GeneID为8198267；所述二羟丙酮激酶基因dak的NCBI
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GeneID为8200330；所述木糖还原酶Xyr的NCBI
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GeneID为5127438；所述木糖醇脱氢酶Xdh的NCBI
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GeneID为MF139767.1；所述木酮糖激酶Xyk的NCBI
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GeneID为5124047；所述1,6
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果糖双磷酸酶fbp的NCBI
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GeneID为8196585；所述1,6
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二磷酸果糖醛缩酶fba的NCBI
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GeneID为8198238；所述转醛缩酶基因tal的NCBI
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GeneID为8199670。3.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为解脂耶氏酵母Po1f（YarrowialipolyticaPo1f）。4.权利要求1或2所述的重组解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）向解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）基因组中导入甲醇代谢模块得到菌株Y001，所述甲醇代谢模块包含甲醇氧化酶基因aox、过氧化氢酶基因cta、二羟丙酮合酶基因das、和二羟丙酮激酶基因dak；（2）在Y001基础上导入季也蒙毕赤酵母来源的木糖代谢模块，进一步结合人工驯化，得到可以利用木糖作为唯一碳源的菌株Y002，所述季也蒙毕赤酵母来源的木糖代谢模块包含木糖还原酶基因xyr、木糖醇脱氢基因xdh和木酮糖激酶基因xyk；（3）将毕赤酵母中木酮糖
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磷酸再生的关键基因1,6
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果糖双磷酸酶基因fbp、1,6
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二磷酸果糖醛缩酶基因fba和转醛缩酶基因tal引入菌株Y002中，得到重组解脂耶氏酵母基因工程菌Y003。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，构建TEF
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aox1...

【专利技术属性】
技术研发人员：章文明，张尚杰，姜岷，蒋羽佳，董维亮，信丰学，方艳，马江锋，周杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：