【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶的筛选方法，更具体地说涉及一种聚酯解聚酶的筛选方法。
技术介绍
1、合成塑料给人类的生活带来便利的同时，废弃塑料的处理不当也会造成严重的环境污染。利用微生物及其产生的酶来降解塑料是一种可持续和环境友好的处理废弃塑料的策略。虽然聚酯塑料的生物降解已经研究多年，但发现和鉴定新的聚酯解聚酶或微生物仍然费时费力。目前的筛选新型降解微生物和酶的方法的主要问题是分析检测较慢、操作较复杂且筛选效率较低。因此，建立具有快速具有高特异性与灵敏度的分析检测方法用于塑料解聚酶的高通量筛选，具有重要意义。而荧光探针技术具有灵敏度高、选择性好、实时监测等优点。现有技术中，通过荧光探针设计来筛选聚酯塑料解聚酶的方法也较多。然而目前的主要策略是设计类似于聚酯结构的小分子探针，虽然能够很大地提高聚酯解聚酶的筛选效率，但其响应机制导致其必然会筛出很多只会对小分子酯类有水解效果而对大分子聚酯类塑料没有解聚效果或效果很差的酶。因此，开发能够快速筛选聚酯解聚酶并分析检测其活性，同时最大限度排除对大分子聚酯解聚效果差的酶的方法是非常有必要的。
技术实现思路
1、本专利技术目的是克服现有技术存在的不足，提供一种聚酯解聚酶的筛选方法，该方法使用聚硫酯作为底物，该聚硫酯解聚时可引起巯基识别荧光探针的响应，也就是说该聚硫酯被有效的聚酯解聚酶解聚后产生游离巯基，被巯基识别探针捕获，并导致荧光发生变化，从而实现聚酯解聚酶的快速筛选。
2、本专利技术的技术构思和原理如下：聚硫酯pets2和pets1在被解
3、本专利技术的技术方案如下：
4、本专利技术聚酯解聚酶的筛选方法，包括以下步骤：使用如式i所示结构聚硫酯作为底物，该底物含有硫酯键结构，其被有效酶分解后产生游离巯基，再用巯基识别探针捕获巯基并导致荧光发生变化，实现聚酯解聚酶的快速筛选；
5、
6、其中，x为s或o，x为s时式i所示结构名称为：聚对苯二甲酸乙二硫醇酯，x为o时式i所示结构名称为：聚对苯二甲酸2-巯基乙醇酯。
7、本专利技术上述的聚酯解聚酶的筛选方法，其进一步的技术方案是所述的聚硫酯的制备方法包括以下步骤：
8、将对苯二甲酰氯、1，2-乙二硫醇或2-巯基乙醇和三乙胺加入到环己烷和环己酮混合溶液中反应，反应后进行纯化得到的固体即为聚对苯二甲酸乙二硫醇酯或聚对苯二甲酸2-巯基乙醇酯。
9、本专利技术上述的聚酯解聚酶的筛选方法，其再进一步的技术方案是所述的反应其条件是氮气保护下搅拌，反应温度40-60℃，时间6个小时以上。
10、本专利技术上述的聚酯解聚酶的筛选方法，其再进一步的技术方案还可以是所述的纯化步骤为：将反应液减压抽滤，用水和乙醇洗涤，收集沉淀物，真空干燥12小时以上即得聚对苯二甲酸乙二硫醇酯或聚对苯二甲酸2-巯基乙醇酯的纯品。
11、本专利技术的方法是聚硫酯和巯基识别荧光探针联用，可实现对聚酯解聚酶和微生物的筛选。可以通过荧光来表征聚硫酯的酶解动力学过程，结合液滴微流控实现对lcciccg的高达106滴/h的筛选；结合酶标仪平台，实现对产lcciccg的大肠杆菌的荧光响应分析。
12、本专利技术具有以下有益效果：
13、1)本专利技术的方法其用于聚酯解聚酶筛选的聚硫酯在ph＝7.4的pbs缓冲溶液中分散，被有效的聚酯解聚酶(以lcciccg为例)解聚后产生游离巯基，可被巯基识别探针捕获并导致荧光发生变化。以fl-st为例，fl-st与游离巯基发生1,4-迈克尔加成，导致荧光素母体螺环打开，增大共轭结构，绿色荧光显著增强。
14、2)本专利技术的方法其用于聚酯解聚酶筛选的聚硫酯，对lcciccg的荧光响应较强，而对poa、ure、goa、ntr、typ、lip和ple等的荧光响应较弱，具有较好的选择性和特异性。
15、3)本专利技术的方法其通过聚硫酯及其荧光响应策略，可用于酶水解聚硫酯底物pets2和pets1过程的动力学监测；也可用于检测聚酯解聚酶的酶活，孵育10分钟的检测限为0.065u/ml，孵育30分钟的检测限可达到0.037u/ml。
16、4)本专利技术的方法其通过聚硫酯及其荧光响应策略，可与液滴微流控结合，通过荧光强度差异，实现对聚酯解聚酶(lcciccg)高达106滴/h的分选。
17、5)本专利技术的方法其通过聚硫酯及其荧光响应策略，结合酶标仪平台，通过nem排除残留培养基中生物硫醇的干扰，实现对产lcciccg的大肠杆菌的荧光响应分析。
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1.一种聚酯解聚酶的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的聚酯解聚酶的筛选方法，其特征在于，所述的聚硫酯的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的聚酯解聚酶的筛选方法，其特征在于，所述的反应其条件是氮气保护下搅拌，反应温度40-60℃，时间6个小时以上。
4.根据权利要求2所述的聚酯解聚酶的筛选方法，其特征在于，所述的纯化步骤为：将反应液减压抽滤，用水和乙醇洗涤，收集沉淀物，真空干燥12小时以上即得聚对苯二甲酸乙二硫醇酯或聚对苯二甲酸2-巯基乙醇酯的纯品。
【技术特征摘要】
1.一种聚酯解聚酶的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的聚酯解聚酶的筛选方法，其特征在于，所述的聚硫酯的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的聚酯解聚酶的筛选方法，其特征在于，所述的反应其条件是氮气保护下...
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