【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于天然产物合成生物，更具体地，涉及以纤维素、半纤维素为碳源生物合成对香豆酸的工程菌，尤其涉及以纤维素、半纤维素为碳源生物合成对香豆酸的酵母工程菌和应用。
技术介绍
1、对香豆酸是一种酚酸类物质，是黄酮类化合物的重要前体，在食品、医药、化妆品等领域被广泛应用。对香豆酸的传统植物提取方法受制于植物生长周期长，化学合成方法存在副产物多、污染大等缺点，对香豆酸的生物合成方法成为研究热点。目前基于常规碳源葡萄糖的对香豆酸生物合成的代谢工程已经建立，但缺乏以纤维素、半纤维素为碳源生物合成对香豆酸的工程菌和方法。由于纤维素、半纤维素生物质是自然界最丰富的可再生资源，迫切需要构建纤维素和半纤维素降解的细胞工厂以生物合成对香豆酸。解脂耶氏酵母被认为是“generally regarded as safe”(gras)安全酵母，在食品、医药、化妆品等工业上具有广泛应用前景。其碳源利用谱广，可利用多种廉价基质进行高密度发酵，但不能利用纤维素和半纤维素。成熟的遗传操作平台、较为清晰的代谢途径、基因组信息使该酵母成为优异的异养宿主细胞。更为重要的是，解脂耶氏酵母含有丰富的乙酰辅酶a库，用来生物合成以乙酰辅酶a为前体的多种化学品。本专利技术以解脂耶氏酵母为底盘，攻克了纤维素和半纤维素降解模块与对香豆酸合成模块耦合的技术难题，构建了解脂耶氏酵母的纤维素和半纤维素降解细胞工厂，并以羧甲基纤维素钠和木聚糖作为纤维素和半纤维素的模式底物，实现了对香豆酸的生物合成。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本
2、根据本专利技术第一方面，提供了一种重组质粒组合，同时包括重组质粒p71tal、p71aro4k221l、p71aro3k222l、p71bgli、p71bglii、p71eg和p71cbh；或者同时包括重组质粒p71tal、p71aro4k221l、p71aro3k222l、p71xynd、p71xr、p71xk、p71xdh和p71xt；
3、所述p71tal为在puaxp7166ii载体的noti和clai位点携带tal序列，puaxp7166ii载体序列与tal基因序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示；
4、所述p71aro4k221l为将aro4k221l插入到puaxp7166ii的noti和clai位点之间，aro4k221l序列如seq id no.3所示；
5、所述p71aro3k222l为将aro3k222l插入到puaxp7166ii的noti和clai位点之间，aro3k222l序列如seq id no.4所示；
6、所述p71bgli为将bgli插入到puaxp7166iii载体上的noti和clai位点之间，puaxp7166iii载体序列与bgl1基因序列分别如seq id no.5、seq id no.6所示；
7、所述p71bglii为将bglii插入到puaxp7166iii载体上的noti和clai位点之间，bglii基因序列如seq id no.7所示；
8、所述p71eg为将eg插入到puaxp7166iii载体上的noti和clai位点之间，eg基因序列如seq id no.8所示；
9、所述p71cbh为将cbh插入到puaxp7166iii载体上的noti和clai位点之间，cbh基因序列如seq id no.9所示；
10、所述p71xynd为将xynii-2a-xlnd插入到puaxp7166iii载体上的noti和clai位点之间，xynii与xynd基因序列分别如seq id no.10、seq id no.11所示；
11、所述p71xr为将xr插入到puaxp7166ii载体上的noti和clai位点之间，xr基因序列如seq id no.12所示；
12、所述p71xk为将xk插入到puaxp7166ii载体上的noti和clai位点之间，xk基因序列如seq id no.13所示；
13、所述p71xdh为将xdh插入到puaxp7166ii载体上的noti和clai位点之间，xdh基因序列如seq id no.14所示；
14、所述p71xt为将xt插入到puaxp7166ii载体上的noti和clai位点之间，xt基因序列如seq id no.15所示。
15、根据本发专利技术另一方面，提供了一种工程菌，由所述的重组质粒组合中的单个重组质粒全部转入宿主细胞得到；
16、优选地，步骤(1)中，在完成所有单个重组质粒的转化后，再次p71tal重组质粒的转化；
17、所述p71tal重组质粒为在puaxp7166ii载体的noti和clai位点携带tal序列，puaxp7166ii载体序列与tal基因序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示。
18、优选地，所述宿主细胞为酵母细胞。
19、优选地，所述酵母细胞为解脂耶氏酵母、酿酒酵母或毕赤酵母。
20、根据本发专利技术另一方面，提供了所述的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
21、(1)将所述的重组质粒组合中的单个重组质粒分别用nsii限制性内切酶进行线性化，依次转化解脂耶氏酵母；每当一种线性化的重组质粒转化解脂耶氏酵母后，再接种于md液体培养基中，恒温摇床中培养，吸取菌液再次接种于md液体培养基中，再进行恒温培养，待其培养基浑浊后吸取菌液接种于mo培养基中，恒温培养后，用蘸取菌液在ypd固体平板上划线，挑取单克隆分别依次点板于md固体平板和ypd固体平板上，挑取在md平板不能生长而在ypd平板上可以生长的单菌落接种于ypd培养基中培养，然后再转化另一种线性化的重组质粒，直到完成所有单个重组质粒的转化，再提取菌液酵母基因组；
22、(2)以酵母基因组为模板进行pcr扩增验证，扩增出正确条带大小的菌株为目的基因成功整合的中间工程菌；两种重组质粒组合中的所有目的基因全部转化并验证成功后，获得了能降解纤维素的工程菌。
23、优选地，步骤(1)中，在完成所有单个重组质粒的转化后，再次进行所述的重组质粒组合中的p71tal重组质粒的转化。
24、根据本发专利技术另一方面，提供了任意一项所述的工程菌在生物合成对香豆酸中的应用。
25、优选地，所述应用为以纤维素和/或半纤维素为碳源生物合成对香豆酸。
26、优选地，将所述工程菌接种于ypd液体培养基中，恒温培养后，吸取菌液，经离心洗涤后，将本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组质粒组合，其特征在于，同时包括重组质粒p71TAL、p71ARO4K221L、p71ARO3K222L、p71BGLI、p71BGLII、p71EG和p71CBH；或者同时包括重组质粒p71TAL、p71ARO4K221L、p71ARO3K222L、p71XynD、p71XR、p71XK、p71XDH和p71XT；
2.一种工程菌，其特征在于，由权利要求1所述的重组质粒组合中的单个重组质粒全部转入宿主细胞得到；
3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为酵母细胞。
4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述酵母细胞为解脂耶氏酵母、酿酒酵母或毕赤酵母。
5.如权利要求2-4任意一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要5所述的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，在完成所有单个重组质粒的转化后，再次p71TAL重组质粒的转化；
7.如权利要求2-4任意一项所述的工程菌在生物合成对香豆酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述工程菌接种于YPD液体培养基中，恒温培养后，吸取菌液，经离心洗涤后，将收集的菌体接种于含有纤维素和/或半纤维素的培养基中发酵培养，所述菌体降解纤维素得到对香豆酸。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述纤维素为羧甲基纤维素钠；所述半纤维素为木聚糖。
...【技术特征摘要】
1.一种重组质粒组合，其特征在于，同时包括重组质粒p71tal、p71aro4k221l、p71aro3k222l、p71bgli、p71bglii、p71eg和p71cbh；或者同时包括重组质粒p71tal、p71aro4k221l、p71aro3k222l、p71xynd、p71xr、p71xk、p71xdh和p71xt；
2.一种工程菌，其特征在于，由权利要求1所述的重组质粒组合中的单个重组质粒全部转入宿主细胞得到；
3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为酵母细胞。
4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述酵母细胞为解脂耶氏酵母、酿酒酵母或毕赤酵母。
5.如权利要求2-4任意一项所述的工程菌的构建方法，其...
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