【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域和分子生态学领域，具体为一种检测大鲵edna的试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、中国大鲵是一种非常古老的两栖动物，进化历史悠久，是世界上现存的最大的两栖类。中国大鲵为我国特有且珍稀的动物种质资源，不仅具有重要的科研意义和生态价值，同时也有巨大的经济价值，在美食、医药、保健等方面均有广泛开发的利用前景。然而，近几十年来，由于生态环境破坏、人工捕捞过度等，野生中国大鲵的种群数量不断减少，地理分布范围不断缩小，面临着灭绝的危险。为了保护该物种，中国政府已采取各种保护措施，但其野外种群生存现状依然不容乐观，在2021年最新的iucn评估中，仍将中国大鲵保留为极度濒危物种等级。
2、目前，人工增殖放流为我国保护中国大鲵的重要举措之一，但对放流后的监测和效果评估却极度缺乏。虽在全国范围内进行大规模放流，但仅有部分地区对放流后的群体进行了监测。其主要原因在于传统监测方法实施难度大、成本过高、过程繁琐，难以实时评估中国大鲵的放流效果。刘萍等利用传统监测方法及edna技术，对浙江古田山国家级自然保护区的中国大鲵放流种群进行监测。edna即环境dna，是指从环境样本中直接获取的dna，包括动植物、微生物在空气、土壤、水体等环境中释放的dna。利用环境dna技术可以有效检测到水体中的稀有物种和隐秘物种，提高调查结果的准确性。
3、ctab法和ctab快速提取法可以获得环境样本中的中国大鲵edna，但传统的ctab提取法耗时久，ctab快速提取法的提取效果不好。
4、相较于传统的监测方法，
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供检测中国大鲵edna的rpa特异性探针和引物组合。
2、本专利技术还提供了检测中国大鲵edna方法。
3、技术方案为，一种用于鉴定大鲵edna的引物和探针组合，包括上游引物(正向引物)、下游引物(反向引物)和探针，选自以下组合中的任一种或多种：
4、(1)seq id no.1-3所示的核苷酸序列；
5、(2)seq id no.4-6所示的核苷酸序列；
6、(3)seq id no.7-9所示的核苷酸序列；
7、(4)seq id no.10-12所示的核苷酸序列。
8、第一对引物、探针组合的核苷酸序列：
9、seq id no.1正向引物ctaaccacatcccataatatatcaaactctaa
10、seq id no.2反向引物ctcttggtctcttatcctaagtctttatatta
11、seq id no.3探针aacctttatattaatatcattattaatcatcctc/dspacer/tctctcatattactccct-c3spacer
12、其中，seq id no.3探针的3’端用c3spacer修饰，第34位核苷酸c用thf修饰。
13、第二对引物、探针组合的核苷酸序列：
14、seq id no.4正向引物tctaagtgtaagtataaatcaaaacgaaccc
15、seq id no.5反向引物gagttccttctttgacttttaatctttctt
16、seq id no.6探针gaaccatattgaaggtaacatctattttaagcaag/dspacer/aaattttgattc-c3spacer
17、其中，seq id no.6探针的3’端用c3spacer修饰，第35位核苷酸g用thf修饰。
18、第三对引物、探针组合的核苷酸序列：
19、seq id no.7正向引物cacccattacacgtcttatcattatcagccc
20、seq id no.8反向引物cctagcatgaaggttgtgtaaaatgtaaaata
21、seq id no.9探针aggtcttgagtgagcccaataagtatttagtcc/dspacer/aataaagaccgctga-c3spacer
22、其中，seq id no.9探针的3’端用c3spacer修饰，第33位核苷酸c用thf修饰。
23、第四对引物、探针组合的核苷酸序列：
24、seq id no.10正向引物cagtaataacattaaaagtcggtaaatccc
25、seq id no.11反向引物cctagcatgaaggttgtgtaaaatgtaaaata
26、seq id no.12探针tcaatgacgaaagtaattctagataatgacc/dspacer/ccacgaaaattaggtt-c3spacer
27、其中，seq id no.12探针的3’端用c3spacer修饰，第31位核苷酸c用thf修饰。
28、所述的引物和探针分别用不同的标记物进行标记；所述的标记物为荧光素和生物素。
29、进一步，用生物素(biotin)标记反向引物(seq id no.2、seq id no.5、seq idno.8、seq id no.11)的5’端，探针(seq id no.3、seq idno.6、seq id no.9、seq idno.12)的5’端用荧光素(fam)标记。
30、一种用于鉴定大鲵edna的试剂盒，包括上所述的引物和探针组合中的至少一组。
31、一种检测大鲵edna的方法，步骤包括：
32、(1)从水样中提取edna，加入上述引物和探针，rpa扩增；
33、(2)将rpa扩增产物滴加到带有抗fam和biotin标记的lfd试纸条上进行检测。
34、步骤(1)中，rpa扩增的条件为，将edna样本溶液与引物、探针和rpa反应体系混合，37-39℃孵育。
35、步骤(2)中，rpa扩增产物稀释10-30倍后滴加到lfd试纸条上。
36、提取edna的方法为：用滤膜过滤水样，抽滤后将滤膜剪碎，加入chelex-100溶液和蛋白酶k，50-60℃孵育5-15分钟；10-20分钟升温至95-100℃；离心取上清液。
37、本专利技术的一个优选方案中，水样用滤膜过滤，抽滤后将滤膜剪碎，加入10％chelex-100溶液和蛋白酶k，56℃孵育10分钟；15分钟升温至99℃；离心取上清液。
38、上述引物探针组合、试剂盒及方法，能够实现快速、便捷地检测大鲵edna，并且灵敏高，特异强，从而实现野外实时监测大鲵。检测限可以达到约0.1ng/ml。...
【技术保护点】
1.用于检测大鲵eDNA的引物和探针组合，包括正向引物、反向引物以及探针，其特征在于，选自以下组合中的任一种或多种：
2.根据权利要求1所述的用于鉴定大鲵eDNA的引物和探针组合，其特征在于，所述的正向引物或反向引物以及探针分别用生物素和羧基荧光素标记。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定大鲵eDNA的引物和探针组合，其特征在于，所述的正反向引物用生物素标记，所述的探针用羧基荧光素标记。
4.根据权利要求1所述的用于鉴定大鲵eDNA的引物和探针组合，其特征在于，所述的SEQ ID No.3探针的3’端用C3spacer修饰，第34位核苷酸C用THF修饰；
5.一种用于鉴定大鲵eDNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物和探针组合。
6.一种检测大鲵eDNA的方法，其特征在于，步骤包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的eDNA提取方法为：
8.权利要求1-4任一项所述的引物和探针在检测中国大鲵eDNA方面的应用。
【技术特征摘要】
1.用于检测大鲵edna的引物和探针组合，包括正向引物、反向引物以及探针，其特征在于，选自以下组合中的任一种或多种：
2.根据权利要求1所述的用于鉴定大鲵edna的引物和探针组合，其特征在于，所述的正向引物或反向引物以及探针分别用生物素和羧基荧光素标记。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定大鲵edna的引物和探针组合，其特征在于，所述的正反向引物用生物素标记，所述的探针用羧基荧光素标记。
4.根据权利要求1所述的用于鉴定大鲵edna的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晨虹，凌岚馨，陈文隽，王慧芳，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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