【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)，具体涉及一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)及其应用。
技术介绍
1、当前世界能源体系面临两大挑战：不断增长的能源需求和急需减少的碳排放。全球能源危机引发了可再生能源前所未有的发展势头，预计2022-2027年期间，全球生物燃料的总需求将增长22％，并有助于保持将全球变暖限制1.5℃的可能性。对于这种能源转型，微藻由于其在固碳和生物能源生产方面的潜能而成为替代传统燃料的一种潜在的可再生绿色能源。
2、微藻是目前已知的单位面积产油能力最高的微生物，在合适的条件下，微藻的含油量可高达其干生物量的30-70％，部分微藻的产油效率可达玉米的795倍，因此被认为是开发生物能源理想的研究对象。
3、斜生栅藻(tetradesmus obliquus)，绿藻门，栅藻属，是常见于淡水中的浮游藻类，常为椭圆形或纺锤形，通常由2-8个细胞(偶数)组成扁平定形群体，可进行自养、混合营养或异养生长，最适生长温度为22-26℃，最适生长ph为6.5-8，抗逆性强，可生长在池塘、水库、水坑、湖泊、沼泽等各种水体环境中，因其对毒物敏感而被广泛用于水环境中污染物的毒性评价。此外，其通过分裂进行繁殖，生长速度快、生物量高、油脂含量高，常规自养条件下，总脂占藻细胞干重的12％-20％，已被探索用于商业用途，并显示出生物燃料生产的巨大潜力。
4、通过优化培养基中c、n、p源可提高斜生栅藻的生物量及脂肪酸合成水平，不同磷供应对斜生栅藻生长和产脂的影响，此外，培养方式也会影响微藻
5、通常压力环境可以提高脂质的产生，氮胁迫作为最常用的方法之一，已被证明可有效促进脂质积累。氮限制条件通常会抑制蛋白质和叶绿素的合成，使碳流流向储能物质—脂质。尽管微藻能源研究在诸多方面已经取得了突破性进展，但低生物质生产力和高成本阻碍了包括生物燃料生产在内的各种微藻产品的商业化。微藻的基因工程被视为解决这一瓶颈的方法。在过去十几年里，微藻基因工程技术的发展取得了长足的进步，为提升微藻能源商业化生产的经济性做出了努力。随着斜生栅藻基因组doe0152z和as-6-11的陆续公布和遗传转化体系的不断成熟，利用基因工程对斜生栅藻脂质代谢通路的关键靶点进行整合和表达成为提升脂质生产力的有效策略。
6、综上，斜生栅藻在生物燃料生产方面显示着巨大潜力，基因工程的引入有望解决生长与产脂之间的矛盾，并提升其经济性。然而，关于利用基因工程以改善斜生栅藻产脂特性的研究非常有限，仍需要进行不断地探索。
7、微藻中脂质的生物合成主要基于两个过程：脂肪酸的从头合成和三酰基甘油(tag)的合成，脂肪酸的从头合成发生在叶绿体中，与co2的固定场所一致，这种空间上的一致性显示了碳流连接的光合固碳与脂质合成之间的密切关系。大气中的co2进入叶绿体后通过卡尔文循环转化为有机物3-磷酸甘油酸(g3p)，而后通过中间体丙酮酸转化为乙酰辅酶a，作为主要底物进入脂肪酸的从头合成。在乙酰辅酶a羧化酶(accase)的催化下，乙酰辅酶a缩合为丙二酰辅酶a，这是脂肪酸合成的第一步，也是限速步骤，因此常被用做基因工程的靶标。接着，丙二酰辅酶a被转移到酰基载体蛋白(acp)上，形成丙二酰-acp，该过程由丙二酰辅酶a-acp转酰化酶(mcat)催化。随后进入由脂肪酸合成酶(fas)复合物催化的“还原-脱水-还原”循环反应，也即双碳单元的顺序缩合，形成c16：0和c18：0-酰基载体蛋白，用作合成tag的前体。
8、tag是微藻中的主要储存脂质，其生物合成发生在内质网和叶绿体中，源于两种不同的途径：甘油途径(酰基辅酶a依赖性途径)和膜脂的再循环(酰基辅酶a非依赖性途径)。甘油途径主要是酰基辅酶a到甘油-3-磷酸的三次连续酰基转移，该途径始于甘油-3-磷酸，在甘油-3-磷酸酰基转移酶(gpat)的催化下形成溶血磷脂酸，溶血磷脂酸酰基转移酶(lpat)进一步将其转化为磷脂酸，随后去磷酸化形成二酰基甘油(dag)，在酰化的最后一步，第三个酰基辅酶a结合在dag上形成tag。该过程通过关键酶二酰基甘油酰基转移酶(dgat)的催化，编码dgat的基因过表达是迄今为止增加微藻中tag含量的常用策略。在非依赖途径中，磷脂二酰基甘油酰基转移酶(pdats)催化酰基从脂质供体(如膜磷脂)直接转移到dag，形成tag。这种途径对于营养缺陷条件下脂质的动员至关重要。研究发现，在对缺氮培养的小球藻utex29的超微结构进行放射性示踪研究时，膜回收是氮饥饿诱导的tag积累的主要贡献者。
9、大多数代谢工程策略都集中在操纵fa从头合成和tag合成的关键酶，希望增加tag产生的代谢通量。通过对关键基因进行过表达和敲除，分析其功能和在脂质生成中的作用，发现脂质积累在很大程度上与脂肪酸的从头合成无关，而tag合成的关键酶gpat、lpat、pap、dgat、pdat等通过单基因或多基因表达的方式都表现出不同程度的促脂作用。此外，增加乙酰coa和nadph的供应，提升光合效率，阻断脂质合成的竞争途径，调控转录因子bzip、bhlh、zncys等的表达，抑制脂质的降解等方法也是目前提升微藻脂质积累常用的手段。
10、nadph，即还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，是电子受体nadp+接受电子后的产物，作为代谢网络中的关键辅助因子之一，在生物体的生化反应和生理功能中起着重要作用。一方面，nadph可以保护细胞免受氧化还原应激；另一方面，它是驱动细胞合成脂肪酸、胆固醇、氨基酸和核苷酸的主要还原当量。
11、nadph的供应对于脂质的合成是必不可少的，因此被认为是脂质合成的限制因素。目前研究者认为微藻中能够促进nadph生成的酶主要有苹果酸酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，且其在促进脂质积累方面的研究已有大量报道。此外，参与产生细胞还原力的酶有亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)，但迄今为止尚未有利用其提高微藻nadph生产率的研究报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)及其应用，mthfd是叶酸依赖性单碳代谢的关键酶，主要参与氨基酸代谢、核苷酸代谢、维生素原合成、甲酰化蛋氨酸trna等重要生理过程，为生物的生长提供了关键的基石。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
3、一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)，其特征在于，亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylene tetrahydrofolate dehydrogenase，mthfd)，是一种参与真核生物单碳代谢的酶，在真核生物人类中，mthfd家族基因包括mthfd1、mthfd1l、mthfd2和mthfd2l，其中胞质蛋白mthfd1是一种具有脱氢酶、环水解酶和合成酶活性的三功能酶，线粒体蛋白mthfd2和mthfd2l是双功能酶]，mthfd1l是单功能酶，只有合成酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)，其特征在于，亚甲基四氢叶酸脱氢酶(Methylene tetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD)，是一种参与真核生物单碳代谢的酶，在真核生物人类中，MTHFD家族基因包括MTHFD1、MTHFD1L、MTHFD2和MTHFD2L，其中胞质蛋白MTHFD1是一种具有脱氢酶、环水解酶和合成酶活性的三功能酶，线粒体蛋白MTHFD2和MTHFD2L是双功能酶]，MTHFD1L是单功能酶，只有合成酶活性。
2.根据权利要求1所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)，其特征在于，一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)应用于参与的叶酸代谢除了具有产生用于生物合成的一碳单元的功能外，还具有产生还原力以缓解氧化应激的作用。
3.根据权利要求1所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)，其特征在于，一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的家族基因中过表达MTHFD1和MTHFDL应用于脂肪酸合成中提高NADPH水平。
4.根据权利要求1所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)，其
5.一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的构建方法，其特征在于，包括以下步骤；
6.根据权利要求4所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的构建方法，其特征在于，所述的基因克隆与载体构建，包括一下步骤：
7.根据权利要求4所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的构建方法，其特征在于，所述的基因克隆与载体构建，所述的同源重组法构建载体，将重组产物进行转化其特征在于，包括以下步骤:
8.根据权利要求4所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的构建方法，其特征在于，所述的基因克隆与载体构建，所述的电击法构建转化藻株，其特征在于，包括以下步骤:
9.根据权利要求5所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的构建方法，其特征在于，MTHFD基因CDS区全长1299bp，编码432个氨基酸，蛋白大小约为45.75kDa，CD-Search显示在细菌中其保守域FoID主要位于第143-428个氨基酸之间，所述的CDS序列：
10.根据权利要求5所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的构建方法，其特征在于，所述的蛋白序列为：
...【技术特征摘要】
1.一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)，其特征在于，亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylene tetrahydrofolate dehydrogenase，mthfd)，是一种参与真核生物单碳代谢的酶，在真核生物人类中，mthfd家族基因包括mthfd1、mthfd1l、mthfd2和mthfd2l，其中胞质蛋白mthfd1是一种具有脱氢酶、环水解酶和合成酶活性的三功能酶，线粒体蛋白mthfd2和mthfd2l是双功能酶]，mthfd1l是单功能酶，只有合成酶活性。
2.根据权利要求1所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)，其特征在于，一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)应用于参与的叶酸代谢除了具有产生用于生物合成的一碳单元的功能外，还具有产生还原力以缓解氧化应激的作用。
3.根据权利要求1所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)，其特征在于，一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)的家族基因中过表达mthfd1和mthfdl应用于脂肪酸合成中提高nadph水平。
4.根据权利要求1所述的一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)，其特征在于，一种亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mthfd)应...
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